1. В случае прекращения у гражданина права пользования жилым помещением по основаниям, предусмотренным настоящим Кодексом, другими федеральными законами, договором, или на основании решения суда данный гражданин обязан освободить соответствующее жилое помещение (прекратить пользоваться им). Если данный гражданин в срок, установленный собственником соответствующего жилого помещения, не освобождает указанное жилое помещение, он подлежит выселению по требованию собственника на основании решения суда.

2. В случае, если гражданин, пользующийся жилым помещением на основании решения суда, принятого с учетом положений части 4 статьи 31 настоящего Кодекса, или на основании завещательного отказа, использует это жилое помещение не по назначению, систематически нарушает права и законные интересы соседей или бесхозяйственно обращается с жилым помещением, допуская его разрушение, собственник жилого помещения вправе предупредить данного гражданина о необходимости устранить нарушения. Если указанные нарушения влекут за собой разрушение жилого помещения, собственник жилого помещения также вправе назначить данному гражданину разумный срок для проведения ремонта жилого помещения. В случае, если данный гражданин после предупреждения собственника жилого помещения продолжает нарушать права и законные интересы соседей, использовать жилое помещение не по назначению или без уважительных причин не проведет необходимый ремонт, данный гражданин по требованию собственника жилого помещения подлежит выселению на основании решения суда.

Комментарий к Ст. 35 ЖК РФ

1. Действие комментируемой статьи распространяется на граждан, имеющих право пользование жилыми помещениями частного жилищного фонда и не являющихся собственниками этих жилых помещений. Это могут быть члены семьи собственника жилого помещения, бывшие члены семьи собственника жилого помещения, члены семьи прежнего собственника жилого помещения, граждане, проживающие в жилом помещении на основании завещательного отказа.

В случае прекращения права пользования жилым помещением названных выше граждан они могут быть выселены из занимаемого ими жилого помещения.

2. К членам семьи собственника жилого помещения согласно ст. 31 ЖК РФ относятся проживающие совместно с этим собственником его супруг, дети и родители. Другие родственники, нетрудоспособные иждивенцы и иные граждане могут быть признаны членами семьи собственника, если они вселены собственником в качестве членов своей семьи. Право пользования жилым помещением у них прекращается в случае прекращения семейных отношений с собственником жилого помещения, например прекращения брака. Если бывшие члены семьи собственника жилого помещения в срок, установленный собственником соответствующего жилого помещения, не освобождают указанное жилое помещение, они подлежит выселению по требованию собственника на основании решения суда (см. комментарий к ст. 31 ЖК).

3. Согласно п. 2 ст. 292 ГК РФ переход права собственности на жилое помещение является основанием для прекращения права пользования этим жилым помещением членами семьи прежнего собственника, если иное не установлено федеральным законом. Члены семьи собственника жилого помещения не имеют права распоряжения этим помещением. При отчуждении жилого помещения его собственником у членов его семьи прекращается право пользование этим помещением.

Смена собственника жилого помещения происходит и в случае смерти собственника помещения. При этом право пользования жилым помещением членами семьи прежнего собственника прекращается.

В случае отказа освободить жилое помещение члены семьи прежнего собственника жилого помещения подлежат выселению из этого помещения в судебном порядке на основании заявления его собственника.

4. Граждане могут приобрести право пользования жилым помещением на основании завещательного отказа. На наследника, которому переходит по завещанию жилое помещение, завещатель вправе возложить обязанность предоставить лицу, указанному в завещании, право пользования этим жилым помещением или отдельной его частью на период жизни этого лица либо на иной срок (ст. 1137 ГК). Если в завещании установлен иной срок (не пожизненно), на который наследник обязан предоставить право пользования жилым помещением гражданину, то истечение этого срока является основанием для прекращения права пользования жилым помещением гражданином, которому это право было предоставлено завещательным отказом. Данный гражданин может быть выселен собственником жилого помещения (см. комментарий к ст. 33 ЖК).

При последующем переходе права собственности на имущество, входившее в состав наследства, к другому лицу право пользования этим имуществом, предоставленное по завещательному отказу, сохраняет силу. Однако при выкупе жилого помещения в случае изъятия земельного участка для государственных или муниципальных нужд право пользования гражданином, которому это право предоставлено завещательным отказом, прекращается.

Указанные лица подлежат выселению из выкупленного жилого помещения без предоставления другого жилого помещения.

5. В случае, когда члены семьи собственника жилого помещения, бывшие члены семьи собственника, пользование жилым помещение которых производится на основании решения суда, или граждане, проживающие в жилом помещении на основании завещательного отказа, используют это жилое помещение не по назначению, систематически нарушают права и законные интересы соседей или бесхозяйственно обращаются с жилым помещением, допуская его разрушение, собственник жилого помещения вправе предупредить их об устранении этих нарушений и назначить разумный срок для проведения ремонта в жилом помещении либо для устранения нарушения.

Если названные граждане после предупреждения собственника жилого помещения продолжают нарушать права и законные интересы соседей, использовать жилое помещение не по назначению или без уважительных причин не проведут необходимый ремонт, то по иску собственника жилого помещения эти граждане подлежат выселению без предоставления другого жилого помещения.

После выселения указанных выше граждан обязанность в проведении ремонта лежит на собственнике этого жилого помещения.

6. Если члены семьи собственника жилого помещения, бывшие члены семьи собственника, пользование жилым помещением которых производится на основании решения суда, или граждане, проживающие в жилом помещении на основании завещательного отказа, самовольно произвели переустройство или перепланировку занимаемого помещения, то орган местного самоуправления направляет собственнику жилого помещения уведомление о приведении этого жилого помещения в разумный срок в первоначальное состояние. Собственник жилого помещения вправе уведомить лиц, имеющих право пользования этим помещением и самовольно произведших переустройство или перепланировку, о приведении жилого помещения в прежнее состояние. Но при этом ответственность за действия этих лиц несет собственник. Приведение жилого помещения его собственником в прежнее состояние является основанием для взыскания с лиц, самовольно произведших переустройство или перепланировку, возмещения ущерба. Думается, что такие действия лиц, имеющих право пользования помещением, могут служить основанием для выселения их из жилого помещения по требованию его собственника.

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 35 ЗК РФ

1. При переходе права собственности на здание, сооружение, находящиеся на чужом земельном участке, к другому лицу оно приобретает право на использование соответствующей части земельного участка, занятой зданием, сооружением и необходимой для их использования, на тех же условиях и в том же объеме, что и прежний их собственник.

В случае перехода права собственности на здание, сооружение к нескольким собственникам порядок пользования земельным участком определяется с учетом долей в праве собственности на здание, сооружение или сложившегося порядка пользования земельным участком.

2. Утратил силу с 1 марта 2015 года. — Федеральный закон от 23.06.2014 N 171-ФЗ.

3. Собственник здания, сооружения, находящихся на чужом земельном участке, имеет преимущественное право покупки или аренды земельного участка, которое осуществляется в порядке, установленном гражданским законодательством для случаев продажи доли в праве общей собственности постороннему лицу.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

4. Отчуждение здания, сооружения, находящихся на земельном участке и принадлежащих одному лицу, проводится вместе с земельным участком, за исключением следующих случаев:

1) отчуждение части здания, сооружения, которая не может быть выделена в натуре вместе с частью земельного участка;

2) отчуждение здания, сооружения, находящихся на земельном участке, изъятом из оборота в соответствии со статьей 27 настоящего Кодекса;

3) отчуждение сооружения, которое расположено на земельном участке на условиях сервитута, на основании публичного сервитута.

Отчуждение здания, сооружения, находящихся на ограниченном в обороте земельном участке и принадлежащих одному лицу, проводится вместе с земельным участком, если федеральным законом разрешено предоставлять такой земельный участок в собственность граждан и юридических лиц.

Не допускается отчуждение земельного участка без находящихся на нем здания, сооружения в случае, если они принадлежат одному лицу.

Отчуждение участником долевой собственности доли в праве собственности на здание, сооружение или отчуждение собственником принадлежащих ему части здания, сооружения или помещения в них проводится вместе с отчуждением доли указанных лиц в праве собственности на земельный участок, на котором расположены здание, сооружение.

5. Иностранные граждане, лица без гражданства и иностранные юридические лица — собственники зданий, сооружений, находящихся на чужом земельном участке, имеют преимущественное право покупки или аренды земельного участка в порядке, установленном настоящей статьей, и в соответствии с пунктом 2 статьи 5, пунктом 3 статьи 15, пунктом 1 статьи 22 настоящего Кодекса. Президент Российской Федерации может установить перечень видов зданий, сооружений, на которые это правило не распространяется.

Комментарий к Статье 35 Земельного кодекса РФ

1. Пункт 1 комментируемой статьи 35 ЗК РФ корреспондирует с положениями ст. ст. 271 и 552 ГК РФ.

Согласно Постановлению Пленума Высшего Арбитражного Суда РФ от 24 марта 2005 г. N 11 «О некоторых вопросах, связанных с применением земельного законодательства» (Вестник ВАС РФ. 2005. N 5) в силу указанных норм покупатель здания, сооружения вправе требовать оформления соответствующих прав на земельный участок, занятый недвижимостью и необходимый для ее использования, на тех же условиях и в том же объеме, что и прежний собственник недвижимости, с момента государственной регистрации перехода права собственности на здание, сооружение.

Если недвижимость находится на земельном участке, принадлежащем продавцу на праве постоянного (бессрочного) пользования, а покупателю согласно ЗК РФ земельный участок на таком праве предоставляться не может, последний как лицо, к которому перешло право постоянного (бессрочного) пользования земельным участком в связи с приобретением здания, сооружения (п. 1 ст. 271 ГК РФ), может оформить свое право на земельный участок путем заключения договора аренды или приобрести его в собственность в порядке, предусмотренном п. 2 ст. 3 Закона о введении в действие ЗК РФ.

При этом, если новый правообладатель недвижимости не приобрел соответствующий земельный участок ни в собственность, ни в аренду, установленные законодательством правила внесения платы за пользование землей исключают возможность лица по собственному усмотрению определять, что именно он будет уплачивать (земельный налог, арендную плату), и самостоятельно выбирать управомоченное на получение этой платы лицо и ее размер. В подобных случаях правовым основанием для взыскания с фактических пользователей земельных участков неосновательно сбереженных ими денежных средств являются ст. 1102 ГК РФ и ст. ст. 35, 36 (с 1 марта 2015 г. — ст. 39.20), 65 ЗК РФ <1>.
———————————
<1> См.: Постановления Высшего Арбитражного Суда РФ от 29 июня 2010 г. N 241/10, от 15 ноября 2011 г. N 8251/11 , Постановление Президиума Высшего Арбитражного Суда РФ от 17 декабря 2013 г. N 12790/13 // Вестник ВАС РФ. 2014. N 3.

Покупатель здания, сооружения, находящихся на земельном участке, принадлежащем продавцу на праве аренды, с момента регистрации перехода права собственности на такую недвижимость приобретает право пользования земельным участком, занятым зданием, сооружением и необходимым для их использования на праве аренды, независимо от того, оформлен ли в установленном порядке договор аренды между покупателем недвижимости и собственником земельного участка.

Такой подход получил дальнейшее развитие в судебной практике. Так, из смысла комментируемых положений следует, что продавец недвижимого имущества, расположенного на арендованном земельном участке, выбывает из правоотношений на земельный участок с момента государственной регистрации перехода права собственности на такую недвижимость. Поэтому с момента государственной регистрации права собственности на объект недвижимости договор аренды продолжает регулировать отношения по пользованию земельным участком уже с новым собственником недвижимости. Переход к другому лицу прав по договору аренды влечет переход встречных обязательств, которые имелись у прежнего собственника <2>.
———————————
<2> См.: Постановление Президиума Высшего Арбитражного Суда РФ от 27 октября 2009 г. N 8611/09, Постановление Федерального арбитражного суда Западно-Сибирского округа от 4 сентября 2013 г. по делу N А75-9436/2012 .

Конституционность п. 1 комментируемой статьи 35 Земельного кодекса РФ, в том числе и его положений, устанавливающих порядок пользования земельным участком в случае перехода права собственности на здание, сооружение к нескольким собственникам, неоднократно пытались оспорить. В связи с этим важно отметить позицию Конституционного Суда РФ, согласно которой указанные положения направлены на определение юридической судьбы земельного участка под объектом недвижимого имущества при его продаже в случаях, когда продавец не являлся его собственником, развивают принцип единства судьбы земельных участков и прочно связанных с ними объектов, согласно которому все прочно связанные с земельными участками объекты следуют судьбе земельных участков, направлены на защиту прав собственника здания, сооружения, а также связаны с требованием стабильности и преемственности ранее сложившихся отношений и не регулируют отношения, связанные с приобретением земельного участка в собственность, а потому сами по себе не могут расцениваться как нарушающие конституционные права. При этом возможность выбора в конкретной ситуации одного из предусмотренных способов определения порядка пользования земельным участком с учетом заслуживающих внимание обстоятельств конкретного дела позволяет учесть многообразие жизненных ситуаций, с тем чтобы обеспечить справедливую защиту прав и баланс интересов всех участников общей собственности <1>.
———————————
<1> См.: Определения Конституционного Суда РФ от 22 марта 2012 г. N 511-О-О, от 22 марта 2012 г. N 512-О-О, от 11 мая 2012 г. N 749-О, от 11 мая 2012 г. N 750-О, от 29 мая 2012 г. N 903-О, от 17 июля 2012 г. N 1372-О, от 24 сентября 2012 г. N 1585-О, от 24 сентября 2012 г. N 1756-О, от 22 ноября 2012 г. N 2099-О, от 17 июня 2013 г. N 993-О .

Одной из проблем реализации комментируемой статьи на практике является вопрос о площади земельного участка, право пользования которым переходит к новому собственнику здания, сооружения, поскольку в ЗК РФ достаточно расплывчато установлено, что переходит «право на использование соответствующей части земельного участка, занятой зданием, сооружением и необходимой для их использования». При этом п. 2 комментируемой статьи 35 ЗК России, устанавливающий правила определения предельных размеров площади такой части земельного участка в соответствии с п. 3 ст. 33 ЗК РФ, с 1 марта 2015 г. признан утратившим силу. Это связано с тем, что предельные размеры земельных участков должны определяться в соответствии с градостроительным регламентом, принимаемым в составе правил землепользования и застройки.

На практике также зачастую возникает вопрос о невозможности оформления прав на земельный участок под объектом недвижимости в силу сохранения прав прежних собственников такой недвижимости на земельный участок. В связи с этим необходимо отметить, что из п. 1 ст. 39.20 (ранее ст. 36) ЗК РФ следует, что собственники зданий, сооружений, расположенных на земельных участках, находящихся в государственной и муниципальной собственности, имеют исключительное право на приватизацию земельных участков или приобретение их в аренду у публичного собственника, а не у обладателя права постоянного (бессрочного) пользования ими.

При наличии у собственника объекта недвижимости исключительного права на приобретение соответствующего земельного участка в собственность или в аренду, прекращение права постоянного (бессрочного) пользования не требуется (см., например, Постановление Президиума ВАС РФ от 3 апреля 2012 г. N 12955/11 ).

Пункт 3 комментируемой статьи предусматривает преимущественное право собственника здания, сооружения, находящихся на чужом земельном участке, на покупку или аренду земельного участка. Порядок реализации преимущественного права покупки регулируется ст. 250 ГК РФ.

По смыслу п. 3 ст. 250 ГК РФ при продаже доли в праве общей собственности с нарушением преимущественного права покупки других участников долевой собственности любой участник долевой собственности имеет право в течение 3 месяцев со дня, когда ему стало известно или должно было стать известно о совершении сделки, требовать в судебном порядке перевода на него прав и обязанностей покупателя.

Исковые требования, предъявленные с пропуском указанного срока, удовлетворению не подлежат. В случае нарушения права преимущественной покупки сособственника недвижимого имущества судебный акт, которым удовлетворен иск о переводе прав и обязанностей покупателя, является основанием для внесения соответствующих записей в ЕГРП.

Следует иметь в виду, что истец в этом случае не имеет права на удовлетворение иска о признании сделки недействительной, поскольку гражданским законодательством предусмотрены иные последствия нарушения требований п. 3 ст. 250 ГК РФ <1>.
———————————
<1> См.: Постановление Пленума Верховного Суда РФ, Пленума Высшего Арбитражного Суда РФ от 29 апреля 2010 г. N 10/22 «О некоторых вопросах, возникающих в судебной практике при разрешении споров, связанных с защитой права собственности и других вещных прав» // Вестник ВАС РФ. 2010. N 6.

Положения комментируемого пункта о преимущественном праве не распространяются на случаи продажи земельного участка с публичных торгов, а также случаи продажи доли в праве общей собственности на земельный участок собственником части расположенного на таком земельном участке здания или сооружения либо собственником помещения в указанных здании или сооружении, поскольку в данном случае отчуждение участником долевой собственности доли в праве собственности на здание, сооружение или отчуждение собственником принадлежащих ему части здания, сооружения или помещения в них проводится вместе с отчуждением доли указанных лиц в праве собственности на земельный участок, на котором расположены здание, сооружение (п. 4 комментируемой статьи).

Кроме того, указанное положение не применяется в случае, если здание, сооружение расположено на земельном участке, находящемся в государственной или муниципальной собственности, поскольку в данном случае собственник таких зданий, сооружений в силу ст. 39.20 ЗК РФ имеет исключительное право приобрести такой участок на соответствующем виде права.

Пункт 4 комментируемой статьи направлен на реализацию принципа земельного законодательства — единства судьбы земельных участков и прочно связанных с ними объектов, а также устанавливает исчерпывающий перечень случаев, когда допускается отчуждение здания, сооружения, находящихся на земельном участке, без одновременного отчуждения земельного участка.

Складывавшаяся ранее судебная практика рассматривала сделки, воля сторон по которым направлена на отчуждение здания, сооружения без соответствующего земельного участка или отчуждение земельного участка без находящихся на нем объектов недвижимости, если земельный участок и расположенные на нем объекты принадлежат на праве собственности одному лицу, как нарушение установленного законом запрета, что в силу ст. 168 ГК РФ влекло за собой ничтожность заключенной сделки <1>.
———————————
<1> Постановление Пленума ВАС РФ от 24 марта 2005 г. N 11 «О некоторых вопросах, связанных с применением земельного законодательства», Определение Верховного Суда РФ от 30 июля 2013 г. N 4-КГ13-24 ; Постановление Пленума Верховного Суда РФ от 29 мая 2012 г. N 9 «О судебной практике по делам о наследовании» (п. 79) // Бюллетень Верховного Суда РФ. 2012. N 7.

Вместе с тем Федеральным законом от 7 мая 2013 г. N 100-ФЗ были внесены изменения в ст. 168 в части отнесения сделок, совершенных с нарушением закона, к оспоримым (подробнее см. комментарий к ст. 26 ЗК РФ).

Положения п. 5 комментируемой статьи 35 ЗК РФ, регулирующей особенности приобретения прав на земельный участок иностранными гражданами, лицами без гражданства и иностранными юридическими лицами — собственниками зданий, сооружений, признаны Постановлением Конституционного Суда РФ от 23 апреля 2004 г. N 8-П не противоречащими Конституции РФ (Бюллетень Верховного Суда РФ. 2014. N 6).

Так, согласно ст. 62 (ч. 3) Конституции РФ иностранные граждане и лица без гражданства пользуются в Российской Федерации правами и несут обязанности наравне с гражданами Российской Федерации, кроме случаев, установленных федеральным законом или международным договором Российской Федерации. Тем самым Конституция РФ в качестве общего принципа российского законодательства устанавливает «национальный режим» для иностранных лиц и лиц без гражданства, т.е. в отношении прав и обязанностей приравнивает их к российским гражданам.

Сама по себе возможность предоставления иностранным гражданам, лицам без гражданства и иностранным юридическим лицам права на определенных условиях приобретать в собственность и в определенных пределах владеть, пользоваться и распоряжаться земельными участками — постольку, поскольку соответствующие земли на основании закона не исключены из оборота или не ограничены в обороте (п. 1 ст. 260 ГК РФ), — не противоречит конституционно-правовому статусу земли как публичного достояния многонационального народа России и вытекает из ст. 9 (ч. 2) и 35 (ч. ч. 1 и 2) Конституции РФ во взаимосвязи с ее ст. 62 (ч. 3).

Осуществляя соответствующее регулирование, федеральный законодатель в силу ст. 55 (ч. 3) Конституции РФ обязан обеспечивать защиту конституционно значимых ценностей и соблюдать баланс конституционных прав, закрепленных, с одной стороны, в указанных статьях Конституции РФ, а с другой — в ст. 9 (ч. 1), согласно которой земля и другие природные ресурсы используются и охраняются в Российской Федерации как основа жизни и деятельности народов, проживающих на соответствующей территории, и в ст. 36 (ч. 1), согласно которой право иметь в частной собственности землю принадлежит гражданам и их объединениям. При этом, однако, он должен исходить из вытекающего из ст. ст. 9 и 36 Конституции России приоритета права российских граждан иметь в собственности землю, обеспечивая рациональное и эффективное использование земли и ее охрану, защиту экономического суверенитета Российской Федерации, целостность и неприкосновенность ее территории (ч. ч. 1 и 3 ст. 4 Конституции РФ).

Реализуя свою конституционную обязанность, федеральный законодатель ввел некоторые ограничения для иностранных граждан, лиц без гражданства и иностранных юридических лиц в осуществлении права землепользования, тем самым установив изъятия из национального режима регулирования права частной собственности на землю.

Надежный, воспроизводимый и количественный анализ тысяч протеомов с помощью микропотоковой ЖХ-МС / МС

Отбор и подготовка образцов

Образцы человека, использованные в этом исследовании, были получены после информированного согласия и соблюдения соответствующего процесса утверждения этических норм Технического университета. Мюнхена. Исследование было одобрено этическим комитетом медицинского факультета Мюнхенского технического университета. Всего у пяти здоровых доноров образцы плазмы объемом 1 мл центрифугировали в течение 10 мин при 4000 g.Всего отбирали 50 мкл супернатанта и разбавляли 5 объемами 8 М мочевинного буфера, содержащего 80 мМ Трис-HCl, pH = 7,6, а затем хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Второе утро в середине потока мочи собирали у здорового донора, немедленно охлаждали до 4 ° C и центрифугировали при 4000 × g при 4 ° C в течение 30 минут для удаления остатков клеток. Супернатант концентрировали в вакууме 5-кратно с использованием SpeedVac, и белки осаждали с использованием пяти объемов ледяного этанола, инкубировали при -20 ° C в течение ночи с последующим центрифугированием при 20000 × g , 4 ° C в течение 30 минут.Осадок растворяли в 8 М буфере мочевины, содержащем 80 мМ Трис-HCl, pH = 7,6, и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. Образцы спинномозговой жидкости (CSF) от пяти человек с рецидивирующим / ремиттирующим рассеянным склерозом (RRMS) и пяти здоровых людей были объединены, чтобы получить образец, достаточный для этого технического исследования. Объединенный CSF хранился при -80 ° C до дальнейшего использования. Поскольку концентрация белка в образце спинномозговой жидкости была очень низкой, буфер с мочевиной не использовали. Около 1 г свежезамороженной ткани плаценты человека промывали пять раз ледяным буфером PBS, содержащим ингибиторы протеаз, с последующим добавлением 3 мл буфера для лизиса, содержащего 8 М мочевину, 80 мМ трис-HCl (pH = 7.6), 1 × ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА (полный мини, Roche). Лизат переносили в пробирки precellys, содержащие керамические шарики, и инкубировали на льду в течение 5 мин. Затем пробирки precellys устанавливали на устройство для измельчения шариков Precellys 24 (Bertin Instruments). Гомогенизацию ткани проводили при 5500 об / мин в течение 2 × 25 с с 5-секундной паузой в течение пяти циклов. Между каждым циклом лизат помещали на лед на 10 мин. Лизат центрифугировали при 20000 g, 4 ° C в течение 30 мин, супернатант хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.Клетки HeLa эпителиальной карциномы шейки матки человека (ATCC, CCL-2) культивировали в среде DMEM (Gibco, Invitrogen) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина (Invitrogen), 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen), при 37 ° C, в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Клетки собирали при ~ 80% конфлюэнтности путем двукратной промывки буфером PBS с последующим добавлением буфера для лизиса, содержащего 8 М мочевину, 80 мМ трис-HCl (pH = 7,6), 1 × ингибиторы протеазы без ЭДТА (полный мини, Roche) и 1 × Ингибиторы фосфатазы (Sigma Aldrich) прямо в планшет для культивирования клеток.Планшет инкубировали на льду 5 мин. Лизат клеток собирали соскабливанием с планшета. После этого лизат центрифугировали при 20 000 × g , 4 ° C в течение 30 мин. Полученный супернатант хранили при -80 ° C до дальнейшего использования. 10 линий клеток поджелудочной железы (BxPC-3 (ATCC, CRL-1687), Dan-G (DSMZ, ACC 249), HPAC (ATCC, CRL-2119), HuPt-4 (DSMZ, ACC 223), IMIM-PC- 1 (PRID, CVCL_4061), MiaPaCa2 (ATCC, CRM-CRL-1420), Panc-10.05 (ATCC, CRL-2547), Pa-Tu-8998-S (DSMZ, ACC 204), Pa-Tu-8998-T (DSMZ, ACC 162) и PSN-1 (ATCC, CRL-3211)) были предоставлены Günter Schneider.Клеточные линии культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика клеточных линий до 60–80% конфлюэнтности. ⁴⁷ . Клетки лизировали 8 М мочевиной, 40 мМ Трис / HCl (pH 7,6), смесью 1х ингибиторов протеазы без ЭДТА (Complete Mini, Roche) и смесью 1х ингибиторов фосфатазы (Sigma-Aldrich). Лизат клеток осветляли центрифугированием при 20 000 × g в течение 20 мин. Супернатанты использовали для расщепления раствора трипсином.

Расщепление белка и обессоливание пептидов

Концентрацию белка измеряли с помощью анализа Брэдфорда.Белки восстанавливали 10 мМ DTT при 37 ° C в течение 60 минут и алкилировали 55 мМ хлорацетамидом (CAA) при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. Для образца CSF раствор белка смешивали с одним объемом 40 мМ Трис-HCl (pH = 7,6). Для всех других образцов раствор белка смешивали с пятью объемами 40 мМ Трис / HCl (pH = 7,6). Белки переваривали трипсином для секвенирования (Roche) при соотношении протеазы к белку 1: 100 (мас. / Мас.) В течение 4 часов с последующим добавлением трипсина (1: 100) и инкубацией в течение ночи при 37 ° C.Расщепление останавливали добавлением муравьиной кислоты (FA) до конечной концентрации ~ 1%, и полученную смесь пептидов центрифугировали при 5000 × g в течение 15 мин. Пептиды в супернатанте загружали в картриджи Sep-Pak C18 (Waters) и элюировали 50% ACN, 0,1% FA в воде и сушили в SpeedVac. Образцы хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

TMT-мечение

Для мечения TMT11-plex обессоленные пептиды из HeLa и десять гидролизатов белка линии поджелудочной железы восстанавливали в 0.1% ЖК и пептидную концентрацию определяли с помощью NanoDrop ^TM 2000 (Thermo Scientific). Пептиды из клеточных линий MiaPaCa2, HuPt-4, BxPC-3, HPAC, Panc-10.05, PSN-1, Dan-G, Pa-Tu-8998-S, Pa-Tu-8998-T, IMIM-PC. -1 и HeLa были помечены 126, 127 N, 127 C, 128 N, 128 C, 129 N, 129 C, 130 N, 130 C, 131 N и 131 C реагента TMT11. Мечение TMT проводили в соответствии с опубликованным нами протоколом ⁴⁸ . Вкратце, 200 мкг пептидов каждой из одиннадцати клеточных линий сушили в SpeedVac и восстанавливали в 40 мкл 50 мМ буфера HEPES (pH 8.5). Затем к каждому образцу добавляли 0,2 мг реагента TMT в 10 мкл сухого ACN и смешивали с помощью пипетки. Смесь инкубировали при 25 ° C и 400 об / мин на термомиксере в течение 1 ч. После этого к каждому образцу добавляли 4 мкл 5% раствора гидроксиламина для остановки реакции, реакцию проводили при 25 ° C и 400 об / мин на термомиксере в течение 15 мин. Наконец, меченые пептиды объединяли и добавляли 40 мкл 10% FA в 10% ACN. Чтобы избежать одной стадии SpeedVac перед обессоливанием пептидов, объединенные пептиды разбавляли 20 объемами 0.1% FA и очищали картриджем Sep-Pak C18, а элюат сушили в SpeedVac и хранили при -80 ° C до дальнейшего использования.

Автономное фракционирование пептидов с обращенной фазой с высоким pH

Система ВЭЖХ Dionex Ultra 3000, работающая на колонке Waters XBridge BEh230 C18 3,5 мкм 2,1 × 250 мм, использовалась для фракционирования пептидов при скорости потока 200 мкл / мин. Буфер A представлял собой 25 мМ бикарбоната аммония (pH = 8,0), буфер C представлял собой 100% сверхчистую воду (ELGA), буфер D представлял собой 100% ACN, буфер B в этой системе не использовался.Во время разделения доля буфера А поддерживалась на уровне 10%. Фракции собирали каждую минуту, и фракции собирали в 96-луночный планшет. Для немеченых пептидов расщепленные 200 или 400 мкг белка разделяли линейным градиентом от 5% D до 30% D за 87 минут, а затем линейным градиентом от 30% D до 80% D за 5 минут.

Чтобы иметь возможность сравнить результаты, полученные в этом исследовании, с данными из литературы, 92 фракции были собраны (от 2 мин до 94 мин) и затем объединены в 46 фракций путем добавления фракции 47 к фракции 1, фракции 48 к фракции 2 и т. Д. вперед.Расщепленный белок HeLa (200 мкг и 400 мкг) и расщепленный белок плаценты (200 мкг) фракционировали на 46 фракций для сравнения с опубликованными данными. Для переваривания плаценты, используемого для долгосрочного теста из 10 циклов, мы собрали 96 одноминутных фракций (от 1 до 97 минут) и объединили их в 48 фракций (как указано выше). Для пептидов, меченных TMT, 500 мкг объединенных пептидов разделяли линейным градиентом от 9% D до 42% D за 86 минут с последующим линейным градиентом от 42% D до 80% D за 12 минут.96 фракций были собраны и объединены в 48 фракций (как указано выше). Пептидные фракции замораживали в морозильной камере -80 ° C в течение не менее 1 ч и сушили в SpeedVac без предварительного обессоливания.

Разделение фосфопептидов и обогащение Fe-IMAC

Всего 2 мг гидролизата белка HeLa было разделено на колонке Waters XBridge BEh230 C18 3,5 мкм размером 2,1 × 150 мм с линейным градиентом от 4% D до 32% D за 45 мин, с линейным увеличением до 80% D за 6 минут и выдерживали там в течение 3 минут перед тем, как вернуться к 5% D за 2 минуты, и 96 фракций были собраны при 0.5-минутные интервалы. Пептиды объединяли поэтапно от 96–48 до 24–12 фракций, аналогично приведенной выше схеме. Фракции сушили в SpeedVac и хранили при -80 ° C до обогащения фосфопептидами. Фосфопептиды были обогащены из каждой из 12 фракций с использованием Fe (III) -IMAC-NTA (Agilent Technologies) на платформе AssayMAP Bravo (Agilent Technologies). Картриджи IMAC заправляли 100 мкл 99,9% ACN / 0,1% TFA и уравновешивали 50 мкл загрузочного буфера (80% ACN / 0,1% TFA).Образцы растворяли в 200 мкл загрузочного буфера и загружали в картриджи. Картриджи промывали 50 мкл загрузочного буфера и фосфопептиды элюировали 40 мкл 1% аммиака. Фосфопептиды сушили и хранили при -80 ° C до проведения анализа ЖХ-МС / МС.

Kinobeads, AP на основе FLAG и выпадающие списки BioID

Профилирование селективности Kinobeads для AT-9283 было выполнено с использованием стандартного протокола ⁴⁹ . Клетки K-562 (ATCC, CCL-243), COLO-205 (ATCC, CCL-222) и MV-4-11 (ATCC, CRL-9591) культивировали в среде RPMI 1640 (Biochrom GmbH) с добавлением 10% (об. / об.) FBS (Biochrom GmbH) и 1% (об. / об.) антибиотики.Клетки SK-N-BE (2) (ATCC, CRL-2271) выращивали в среде DMEM / Ham’s F-12 (1: 1) с добавлением 10% или 15% (об. / Об.) FBS, соответственно, и 1% (об. / v) антибиотики (Sigma). Клетки OVCAR-8 (RRID: CVCL_1629) культивировали в среде IMDM (Biochrom GmbH) с добавлением 10% (об. / Об.) FBS. Клетки лизировали в 0,8% NP40, 50 мМ Трис-HCl pH 7,5, 5% глицерина, 1,5 мМ MgCl ₂ , 150 мМ NaCl, 1 мМ Na ₃ VO ₄ , 25 мМ NaF, 1 мМ DTT, ингибиторы протеазы (SigmaFast, Sigma) и ингибиторы фосфатазы (приготовленные на месте в соответствии с коктейлем 1, 2 и 3 ингибиторов фосфатазы от SigmaAldrich).2,5 мг белковой смеси из пяти клеточных линий предварительно инкубировали с возрастающими концентрациями соединения (носитель ДМСО, 3 нМ, 10 нМ, 30 нМ, 100 нМ, 300 нМ, 1 мкМ, 3 мкМ, 30 мкМ) в течение 45 мин при 4 ° C в встряхивающем устройстве для встряхивания. Впоследствии лизаты инкубировали с Kinobeads (18 мкл осевших шариков) в течение 30 минут при 4 ° C на встряхивателе для встряхивания. После промывания связанные белки восстанавливали с помощью 50 мМ DTT в 8 М мочевине, 40 мМ Tris HCl (pH = 7,4) в течение 30 минут при комнатной температуре. После алкилирования 55 мМ САА белки расщепляли трипсином.Пептиды обессоливали и концентрировали с использованием планшетов SepPak tC18 µEluation (Waters) и сушили в SpeedVac. Образцы аффинной очистки (AP) и BioID были приготовлены в соответствии с предыдущим протоколом ^50,51 . Вкратце, образцы AP и BioID получали из линий HEK293 Flp-In T-REx, индуцирующих тестовую «приманку» или контроль, которые индуцировали в течение 24 часов с помощью 1 мкМ тетрациклина или одновременно с тетрациклином и 50 мкМ биотина, и собирали на лед. Для BioID осадки клеток ресуспендировали в соотношении клетки: буфер 1:10.Лизис клеточных гранул для очистки BioID (на стрептавидин-сефарозе) проводили в 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1% (мас. / Об.) SDS, 1% NP-40, 1 мМ MgCl ₂ и 1 мМ EDTA, свежеприготовленная с 0,5% конечным (мас. / Об.) Дезоксихолатом натрия и ингибиторами протеаз (№ по каталогу P8340, Sigma-Aldrich). Суспензию обрабатывали ультразвуком 3 раза по 5 с (перерыв 2 с) при 30% амплитуде. ТурбоНуклеазу (BioVision Cat # 9207-50KU; 250 Ед / мкл) и РНКазу (BioBasic Cat # RB0474; 10 мкг / мкл) добавляли в количестве 1 мкл / образец и инкубировали при 4 ° C в течение 30 минут.Всего к образцу добавляли 20% SDS, так что конечная концентрация SDS составляла 0,25%. Эту суспензию хорошо перемешивали и центрифугировали при 14000 × g в течение 20 минут при 4 ° C. Супернатант удаляли в новую пробирку, содержащую 30 мкл слоя стрептавидин-сефарозы, и инкубировали при 4 ° C в течение 3 часов при вращении. Осадки клеток для AP FLAG ресуспендировали в соотношении 1: 4 клетки: буфер. Аффинную очистку FLAG (на магнитных шариках анти-Flag, конъюгированных с M2-антителом, Sigma-Aldrich, M8823) проводили в течение 2 ч при 4 ° C на нутаторе ^50,51 .После этого были выполнены две промывки 1 мл буфера для лизиса с последующей дополнительной промывкой 1 мл 20 мМ TrisHCl, pH 8, и 2 мМ CaCl ₂ . Наконец, образцы трипсинизировали на шариках в течение ночи при 37 ° C с вращением и без алкилирования / восстановления и сушили в SpeedVac.

Настройка интерактивной микропоточной системы ЖХ-МС / МС

В этом исследовании система Dionex UltiMate 3000 RSLCnano была подключена к масс-спектрометру Q Exactive HF-X или Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fisher Scientific) в оперативном режиме.Для окончательной настройки ЖХ мы использовали капилляры nanoViper для всех соединений. Выход насоса был напрямую соединен с клапаном ввода пробы (подсоединенным к одному концу петли пробы) капилляром nanoViper с внутренним диаметром 75 мкм × 550 мм, другой капилляр nanoViper с внутренним диаметром 75 мкм × 550 мм использовался для подключения клапана ввода пробы (подсоединенный к другому концу пробоотборной петли) ко входу колонки. Петля для образца объемом 20 мкл использовалась с системой микропотока ЖХ в режиме прямого впрыска. Во время градиентного элюирования петлю для образца удерживали на линии.Капилляр nanoViper с внутренним диаметром 50 мкм и 350 мм использовался для соединения выхода колонки с заземляющим металлическим соединением источника Ion Max API. Другой капилляр nanoViper с внутренним диаметром 50 мкм и 150 мм использовался для подключения другого конца заземляющего металлического соединения к входу для пробы зонда HESI-II (внутренний диаметр 50 мкм) Ion Max API Source. Глубина зонда была установлена ​​на линию A источника Ion Max API.

Все результаты, представленные в этом исследовании, были получены на коммерческой колонке Thermo Fisher Scientific Acclaim PepMap 100 C18 LC (размер частиц 2 мкм, внутренний диаметр 1 мм × 150 мм; каталожный номер 164711).Температура колонки поддерживалась на уровне 55 ° C с использованием встроенной печи для колонок. В качестве примечания: мы оценили пять партий колонок PepMap, которые были произведены в 2012, 2013, 2017 и 2018 годах соответственно, и обнаружили, что партии 2012 и 2013 годов показали лучшие результаты. эффективность разделения, поэтому в данном исследовании использовалась периодическая колонка 2013 года.

Для подачи градиента использовались три насоса LC, доступные в системе Dionex UltiMate 3000 RSLCnano (загрузочный насос, градиентный насос NC и модифицированный насос Vanquish).Микропоточная система ЖХ – МС / МС изначально была разработана путем создания градиентов с помощью загрузочного насоса. Эксперимент по титрованию ДМСО проводился с использованием загрузочного насоса при скорости потока 68 мкл / мин и с использованием линейных градиентов 5–28% B, 4–27% B, 3–26% B, 2–25% B, 1 –24% B, 0,1–23,1% B для растворителей с добавками 0%, 1%, 2%, 3%, 4% и 5% ДМСО соответственно. Хотя можно использовать загрузочный насос, мы наблюдали довольно длительную задержку градиента, возникающую в результате градиентного перемешивания перед напором загрузочного насоса, что приводило к мертвому объему около 220 мкл.Такие задержки градиента недопустимо велики для градиентов 15 и 30 минут. Поэтому мы установили на насос NC микрометрический расходомер (номер по каталогу 6041.7903 A, максимальный расход 50 мкл / мин) для получения градиента при максимальной скорости потока 50 мкл / мин и с использованием линейного градиента 3–28% B. и включая 3% ДМСО в растворителях ¹⁹ . Эта насосная установка NC использовалась для частей рукописи, посвященных разработке методов, включая градиентные тесты, серийные тесты разведения HeLa, тесты глубинного фракционирования HeLa и переваривания белков плаценты и т. Д.Представленные данные демонстрируют, что установка NC насос / микрометрический расходомер была очень надежной.

Однако, так как максимальная скорость потока для комбинации NC насос / микромеханический расходомер составляет 50 мкл / мин, дополнительное время ЖХ все еще не было оптимальным и должно быть улучшено, особенно для коротких градиентов. Поэтому использовался модифицированный насос Vanquish, способный подавать градиенты до 100 мкл / мин.

Этот модифицированный насос Vanquish является бинарным градиентным насосом и имеет технические характеристики, аналогичные стандартному бинарному градиентному насосу высокого давления в модуле NCS-3500RS (https: // assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/Specification-Sheets/PS-71899-LC-UltiMate-3000-RSLCnano-PS71899-EN.pdf) с объемом задержки насоса <25 нл и максимальным давлением 800 бар. Между выпускным отверстием насоса и жидкостной системой не было установлено дополнительного смесителя. Все наблюдаемые задержки элюирования связаны только с объемом колонки, контуром ввода и капиллярными соединениями между насосом, колонкой, автоматическим пробоотборником, контуром ввода и зондом HESI.

Это позволяет промывать колонку со скоростью потока 100 мкл / мин и сокращать общее время обработки до 5 мин, включая ввод пробы 3 мин и время уравновешивания колонки 2 мин.Скорость потока 50 мкл / мин использовалась для получения линейных градиентов. Эта установка позволила обрабатывать 96 образцов в день с использованием времени градиента 10 минут. Модифицированный насос Vanquish использовался для долговременного теста производительности, включающего 1550 инъекций различных образцов, пептидов, меченных ТМТ, фосфопептидов, раскрывающихся образцов Kinobeads, образцов AP и BioID.

Конечные условия ЖХ, которые мы рекомендуем для микропоточной системы ЖХ, описанной в этом исследовании, следующие: растворитель A: 0.1% ЖК, 3% ДМСО в воде; растворитель B: 0,1% FA, 3% ДМСО в ACN; прямой ввод пробы с использованием растворителя А для загрузки пробы. Для немеченого полного протеомного анализа использовали линейный градиент 3–28% B для всех длин градиента. Вкратце, линейный градиент 3–28% B за 15 мин был использован для глубинного фракционирования немеченых пептидов и всех образцов с выпадающим списком (включая кинобусинки, AP и BioID). В долгосрочном тесте производительности линейный градиент 3–28% B за 30 минут использовался для пептидов мочи, спинномозговой жидкости, плазмы и PROCAL, линейный градиент 3–28% B за 60 минут использовался для пептидов HeLa, и линейный градиент 3–28% B за 15 мин использовали для глубоко фракционированных пептидов плаценты.Для обогащенных фосфопептидов использовали линейный градиент 1–25% B за 60 мин. Для пептидов, меченных ТМТ, были использованы линейные градиенты 7–32% B за 15 минут, 6–33% B за 25 минут.

Для микропотокового ЖХ, соединенного с Q Exactive HF-X, масс-спектрометр Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific) работал следующим образом: положительная полярность; напряжение распыления 3,5 кВ, значение линзы RF на воронке при 40, температура капилляра 320 ° C, температура вспомогательного газового нагревателя 300 ° C.Расходы для защитного газа, вспомогательного газа и продувочного газа были установлены на 32, 5 и 0 соответственно. Если не указано иное, использовался зависимый от данных сбор данных (DDA) с использованием полной установки MS-ddMS ² . Полное разрешение МС было установлено на 60 000 при m / z 200, а целевое значение АРУ для полной МС составляло 3E6 с максимальным временем впрыска (IT) 50 мс. Диапазон масс составлял 360–1300. Целевое значение AGC для спектров фрагментов было установлено на 1E5. Для спектров MS2 минимальная цель AGC поддерживалась на уровне 2E3. Ширина изоляции была установлена ​​на 1.3 m / z, а первая масса была зафиксирована на уровне 100 m / z. Нормированная энергия столкновения была установлена ​​на 28%. Было выбрано предпочтительное соответствие пептидов и включено исключение изотопов. Спектры MS1 и MS2 были получены в профильном и центроидном режимах соответственно. Дополнительные подробности соответствующих методов MS показаны и обсуждаются в рукописи. Значения динамического исключения были установлены на 10 с, 10 с, 15 с, 25 с, 40 с и 50 с для градиентов 10 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин соответственно. Для полного протеомного анализа использовались оптимизированные методы 28 или 41 Гц, которые были оптимизированы в предыдущей литературе ³¹ .Верхние значения N в методах 28 Гц и 41 Гц равны 12 и 18, разрешение спектров MS2 в методах 28 Гц и 41 Гц составляет 15000 и 7500, максимальные значения IT прекурсоров в методах 28 Гц и 41 Гц равны 22. мс и 11 мс. Метод 41 Гц использовался только для теста на разведение перевариваемого белка HeLa с 30-минутным и 60-минутным градиентами. Поскольку мы обнаружили, что метод 28 Гц работает намного лучше в большинстве случаев, метод 28 Гц использовался для всех других образцов полного протеома, включая градиентный тест переваривания белка HeLa, образцы жидкости организма, глубоко фракционированный переваривание белка HeLa и плаценты, киногранулы, AP и Выпадающие образцы BioID и т. Д.Для обогащенных фосфопептидов до 12 предшественников за цикл отбирали для MS2, используя максимальное IT 120 мс, и фрагменты записывали с разрешением 15000. Минимальная цель AGC была установлена ​​на 5E3, все остальные параметры остались прежними. Для пептидов, меченных TMT, целевое значение AGC для спектров фрагментов было установлено на 2E5, до 12 предшественников на цикл было выбрано для MS2, и фрагменты были записаны с разрешением 45000 (максимальное IT 86 мс). Окно изоляции и нормализованная энергия столкновения были установлены на 0.8 m / z и 35, минимальная цель AGC сохранялась на 5E3.

Для микропоточного ЖХ, подключенного к Orbitrap Fusion Lumos, масс-спектрометр (Thermo Fisher Scientific) работал следующим образом: положительная полярность; напряжение распыления 3,5 кВ, температура капилляра 325 ° C; температура испарителя 125 ° C. Расходы защитного газа, вспомогательного газа и продувочного газа были установлены на 32, 5 и 0 соответственно. Для немеченых пептидов полное разрешение MS было установлено на 120000 при m / z 200, полная цель MS AGC была 4E5 с максимальным IT 50 мс, а значение линзы RF было установлено на 40.Диапазон масс был установлен на 360–1300, а свойства MIPS были установлены на пептид. Для спектров MS2 порог интенсивности был установлен на 5E3, заряды по умолчанию были установлены на состояние 2–6. Целевое значение AGC было установлено на 1E4, ширина изоляции была установлена ​​на 0,4 m / z, а первая масса была зафиксирована на уровне 100 m / z. IonTrap использовался для обнаружения спектров MS2 с использованием функции быстрого сканирования. Максимальный IT составлял 10 мс для 15-минутного градиента и 35 мс для 30-минутного градиента. Время цикла было установлено на 0,6 с для 15-минутного градиента и 1 с для 30-минутного градиента.Продолжительность динамического исключения составляла 12 с для 15-минутного градиента и 20 с для 30-минутного градиента, исключая через один раз. Для пептидов, меченных TMT, время цикла было установлено на 1,2 с для 15-минутного и 25-минутного градиентов. Продолжительность динамического исключения была установлена ​​на 40 с для 15-минутного градиента и 50 с для 25-минутного градиента, исключить через один раз. Полное разрешение MS было установлено на 60 000 при m / z 200, а целевое значение полной MS AGC составляло 4E5 с максимальным IT 50 мс, а значение объектива RF было установлено на 50. Диапазон масс был установлен на 360-1500, а свойства MIPS были установлены на пептид.Для спектров MS2 порог интенсивности был установлен на 1E4, заряды по умолчанию были установлены на состояние 2–6. Модель ddMS2 IT HCD использовалась для спектров MS2, ширина изоляции была установлена ​​на 0,6 m / z, тип активации был HCD, энергия столкновения HCD [%] составляла 32. Целевое значение AGC было установлено на 1E4, а первая масса была зафиксировано на 100 м / з. IonTrap использовался для обнаружения спектров MS2 с использованием функции быстрого сканирования. Максимальный IT составлял 15 мс для 15-минутного градиента, 40 мс для 25-минутного градиента. Диапазон выбора прекурсора был установлен на 400–2000, ширина исключения массы была установлена ​​на 20 m / z для низкого и 5 m / z для высокого.Свойства исключения потери изобарической метки были установлены для реагента TMT. Для спектров MS3 использовалась модель ddMS3 OT HCD. Был включен синхронный выбор предшественников, количество предшественников SPS было установлено равным 8, окно изоляции MS составляло 1,2 m / z, тип активации был HCD, а энергия столкновения HCD составляла 55%. Orbitrap использовался для обнаружения спектров MS3 с разрешением 50 000 и диапазоном сканирования 100–1000. Целью AGC было 1E5 с максимальным IT 86 мс для 15-минутного и 25-минутного градиентов.

Nano flow LC – MS / MS

Система Dionex UltiMate 3000 RSLCnano была подключена к масс-спектрометру Q Exactive HF-X или Q Exactive HF.Пептиды загружали в колонку-ловушку (100 мкм × 2 см, заполненную смолой Reprosil-Gold C18 ODS-3 5 мкм, Dr. Maisch) с растворителем A (0,1% муравьиной кислоты в воде для ВЭЖХ) при скорости потока 5 мкл / мин в течение 10 мин и разделены на аналитической колонке (75 мкм × 40 см, заполнены смолой Reprosil-Gold C18 3 мкм, Dr.Maisch) при 300 нл / мин. Аналитическую колонку нагревали до 50 ° C, используя 30-сантиметровый капиллярный нагреватель колонки (ASI, Pompton Plains, NJ). Растворитель B представлял собой 0,1% FA, 5% ДМСО в воде и растворитель C 0.1% ЖК, 5% ДМСО в ACN. Q Exactive HF-X использовали для анализа фосфопептидов и пептидов, меченных TMT. Для фосфопептидов градиент составлял 4–15% C за 40 минут, затем 15–28% C через 20 минут. Для анализа пептидов, меченных TMT, градиент составлял 8–34% C за 15 мин. Параметры MS1 и MS2 были такими же, как и для микропоточной системы ЖХ – МС / МС. Пептиды из образца kinobeads разделяли с помощью той же системы нЖК с использованием линейного градиента от 5 до 33% C за 52 мин. Спектры MS1 были получены с разрешением 60 000 (при m / z 200) в Orbitrap с использованием максимального IT 10 мс и целевого значения автоматической регулировки усиления (AGC) 3E6.Для спектров MS2 было выделено до 12 предшественников пептидов для фрагментации (ширина выделения 1,7 Th, максимальное IT 75 мс, значение AGC 2e5). Прекурсоры были фрагментированы с помощью HCD с использованием 25% нормализованной энергии столкновения (NCE) и проанализированы на орбитальной ловушке с разрешением 15000. Длительность динамического исключения фрагментированных ионов-прекурсоров была установлена ​​на 30 с.

Обработка и анализ данных

Если не указано иное, поиск данных проводился с помощью MaxQuant v1.6.2.3 ⁵² в базе данных UniProtKB Human Reference Proteome (v22.07.13, 88381 запись). Использовались параметры MaxQuant по умолчанию. В качестве фермента был указан трипсин, расщепляющий все остатки лизина и аргинина и допускающий до двух пропущенных расщеплений. Карбамидометилирование цистеина определяли как фиксированную модификацию, а ацетилирование N-конца белка и окисление метионина рассматривали как вариабельные модификации. Уровень ложного обнаружения (FDR) был установлен на 1% для сайта, соответствия пептидному спектру (PSM) и уровней белка. Для теста производительности 1550 инъекций отдельно сравнивались наборы данных HeLa (200 необработанных файлов), мочи (200 необработанных файлов), CSF (200 необработанных файлов), плазмы (200 необработанных файлов) и PROCAL (270 необработанных файлов). база данных эталонного протеома человека UniProtKB (v22.07.13, 88381 запись) с добавлением пептидных последовательностей PROCAL ³² . 480 необработанных файлов образца плаценты были проанализированы в той же базе данных UniProtKB Human Reference Proteome без пептидных последовательностей PROCAL. Была включена функция сопоставления между запусками, временное окно сопоставления и выравнивания было установлено на 0,7 мин и 5 мин. Была включена количественная оценка без меток, а значение минимального соотношения LFQ было установлено равным 2. Для повторного анализа опубликованных наборов данных мы загрузили исходные файлы необработанных данных и повторно провели в них поиск с помощью MaxQuant, как указано выше.

Для данных TMT в качестве конкретных параметров были добавлены поправочные коэффициенты TMT для конкретной партии (номер продукта: и A34807). Данные TMT, сгенерированные методами MS2 и MS3, просматривались вместе, но с разными группами параметров. Точность массы репортерных ионов была установлена ​​на значение по умолчанию 0,003 Да, а допуск MS2 был установлен на 0,4 Да для IT MS. Все остальные параметры были по умолчанию. Для фосфопептидов phopho (STY) был настроен на переменную модификацию.

Мы предположили, что подробная информация, доступная относительно активности связывания ExsA, может быть применима к взаимодействию LcrF / VirF с промоторной ДНК. Используя слияние промоторов, мутагенез и анализы связывания ДНК in vitro, мы обнаружили, что LcrF связывается и активирует транскрипцию ExsA-зависимых промоторов в P.aeruginosa, и эта экспрессируемая плазмидой ExsA дополняет мутант lcrF Y. pestis по экспрессии гена T3SS. Мутации промотора, которые нарушают ExsA-зависимую активацию, также ингибируют активацию LcrF, предполагая, что ExsA и LcrF распознают общую последовательность ДНК. В подтверждение этого вывода, каждая из основных областей промотора T3SS из иерсиний обладает четко определенными консенсусными сайтами связывания ExsA. Наши результаты с LcrF также применимы к активаторам экспрессии гена T3SS из Photorhabdus luminescens, Aeromonas hydrophila и Vibrio parahaemolyticus.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и условия культивирования. Штаммы бактерий, использованные в этом исследовании, представлены в таблице S1 в дополнительном материале. Штаммы Escherichia coli культивировали в бульоне LB-Miller (LB) или в агаре с добавлением ампициллина (100 мкг / мл) или гентамицина (15 мкг / мл) по мере необходимости. Штаммы P. aeruginosa культивировали на агаре с минимальной средой Фогеля-Боннера, содержащим гентамицин (100 мкг / мл) и / или карбенициллин (300 мкг / мл) по мере необходимости (36). Чтобы измерить экспрессию гена T3SS, P.aeruginosa культивировали при 30 ° C в триптиказо-соевом бульоне (TSB) с добавлением 100 мМ глутамата натрия, 1% глицерина и 2 мМ EGTA до оптической плотности при 600 нм (OD ₆₀₀ ) приблизительно 1,0. Активность β-галактозидазы измеряли с использованием субстрата 2-нитрофенил-β-d-галактопиранозида, как описано ранее (12). Все значения, представленные в этом исследовании, представляют собой среднее значение по крайней мере из трех независимых экспериментов.

Штаммы Y. pestis, использованные в этом исследовании, представляют собой Pgm ^– и авирулентны по периферическим путям заражения (37).Y. pestis KIM5-3001 и производные этих штаммов обычно выращивали в жидкой среде с сердечным инфузионным бульоном (HIB) или на чашках с триптозным кровяным агаром (TBA) при температуре 28 ° C. Для экспериментов по секреции штаммы Y. pestis выращивали в присутствии или в отсутствие 2,5 мМ хлорида кальция в тщательно модифицированной среде, определенной Хигачи (TMH), как описано ранее (25).

SDS-PAGE и иммуноблоттинг. Цельноклеточные лизаты P. aeruginosa получали путем сбора 1,25 мл клеточной культуры (OD ₆₀₀ из 1.0) центрифугированием (16000 × г, , 5 мин, 23 ° C), суспендированием в 0,25 мл буфера для образцов 2 × SDS-PAGE и обработкой ультразвуком в течение 5 с. Образцы секретированного белка готовили из 1 мл надосадочной жидкости бесклеточной культуры путем добавления 350 мкл 50% трихлоруксусной кислоты и инкубирования в течение ночи при 4 ° C. Осажденный белок собирали центрифугированием (16000 × g , 15 мин, 23 ° C), промывали ацетоном, сушили и суспендировали в 15 мкл буфера для образцов 2 × SDS-PAGE. Образцы анализировали с помощью 15% SDS-PAGE и подвергали иммуноблоттингу или окрашиванию серебром.

Конструирование мутантов с делецией lcrF . Удаление кодирующей последовательности lcrF и вставка гена kan (KIM5-3233-F2) или dhfr (KIM5-3001-F1) осуществляли с использованием лямбда-красного- опосредованная рекомбинация, по существу, как описано Даценко и Ваннером (38). Продукты ПЦР, используемые для конструирования замен генов, были получены из матричной плазмиды pKD4 ( kan ) или с использованием транспозона EZ :: TN (Epicenter, Madison, WI) в качестве матрицы для ПЦР.Праймеры P1 и P2 (см. Таблицу S2 в дополнительном материале) использовали для амплификации продуктов ПЦР kan и dhfr . Y. pestis KIM5-3001 и KIM5-3233 подвергали электропорации с pKD46, кодирующей красную рекомбиназу. Штаммы Y. pestis, несущие pKD46, выращивали в HIB при 28 ° C до OD ₆₂₀ 0,5, а затем в течение 2 часов с 0,2% l-арабинозы. Электрокомпетентные клетки получали, как описано ранее, и подвергали электропорации с очищенными продуктами ПЦР (39). Замены генов подтверждали с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидов LcrF-F1 и LcrF-R1.Кассета kan , фланкированная мишенью рекомбинации FLP (FRT), была удалена посредством FRT-опосредованной рекомбинации с использованием плазмиды pCP20, как описано ранее (40). Плазмиды pKD46 и pCP20 были излечены от мутантов с делецией Y. pestis путем роста в течение ночи при 39 ° C.

Конструирование плазмиды и сайт-направленный мутагенез. Все репортерные и плазмидные конструкции, использованные в этом исследовании, представлены в таблицах S3 и S4, соответственно, в дополнительном материале. Вектор экспрессии pBAD30-LcrF был сконструирован путем амплификации 0.LcrF-кодирующий фрагмент ДНК размером 9 т.п.н. амплифицирован из плазмиды pCD1 (41) с использованием праймеров для ПЦР LcrF-KpnI (TTTGGTACCTTTAGATTTTTAGGACAGTAT) и LcrF-HindIII (TTTAAGCTTACTTTATAGTCCAAAAGTGTC) (см. Таблицу S2 в дополнительном материале). Продукт ПЦР клонировали в сайты рестрикции KpnI / HindIII pBAD30 (42), генерируя плазмиду pBAD30-LcrF. Вектор экспрессии LcrF (pJK32) был сконструирован путем первого проведения сайт-направленного мутагенеза на pBAD30-LcrF (система QuikChange) с использованием пары праймеров 81126787-81126788 (см. Таблицу S2) для разрушения сайта рестрикции NdeI (путем введения молчащей мутации) в ЛКРФ .Полученную плазмиду (pJK29) использовали в последующей ПЦР с парой праймеров 81559809-81126789 (см. Таблицу S4) для амплификации lcrF . Продукт ПЦР клонировали в сайты рестрикции NdeI / SacI pEB131, который заменяет кодирующую последовательность exsA на lcrF , что приводит к pJK32. Для создания плазмиды экспрессии pET16b lcrF использовали пару праймеров 81559809-82001905 (см. Таблицу S4) для амплификации lcrF , и полученный продукт ПЦР клонировали в сайты рестрикции NdeI / BamHI в pET16b.Для создания плазмиды pVxsA vxsA амплифицировали с помощью ПЦР из геномной ДНК V. parahaemolyticus с использованием пары праймеров 856-86519886 (см. Таблицу S4), и продукт ПЦР клонировали в вектор pEB131, чтобы трансляция контролировалась рибосомным связыванием природного ExsA сайт.

Репортеры транскрипции Y. pestis получали с помощью ПЦР-амплификации областей промоторов P _yopN , P _lcrG и P _yscN с использованием наборов праймеров, указанных в таблице S3 в дополнительном материале.Продукты ПЦР были клонированы в mini-CTX-lacZ в качестве рестрикционных фрагментов EcoRI / HindIII и интегрированы в хромосому PA103, как описано ранее (43). P _yscN мутации промотора вводили с использованием метода двухэтапной ПЦР. P _yscN 5′-Hind праймер (88203767) и специфические праймеры, указанные в таблице S2 в дополнительном материале (minictxJK503-511), использовали для создания мегапраймеров. Мегапраймеры использовали во второй ПЦР с 3 ‘Eco-праймером P _yscN 3′ Eco.Полученные продукты ПЦР клонировали в виде рестрикционных фрагментов HindIII / EcoRI в mini-CTX-lacZ и интегрировали в хромосому PA103, как описано выше.

Экспрессия и очистка белков E. coli Tuner (DE3), несущий вектор экспрессии pET16b exsA или pET16b lcrF , выращивали при 30 ° C в LB с добавлением ампициллина (200 мкг / мл). Когда OD ₆₀₀ культуры достигла 0,5, добавляли изопропил-β-d-тиогалактопиранозид (IPTG) (конечная концентрация 1 мМ) для индукции экспрессии ExsA или LcrF.Культуры инкубировали дополнительно от 2 до 4 часов при 30 ° C. Клетки собирали центрифугированием (6000 × г , 10 мин, 4 ° C) и суспендировали в 30 мл буфера ExsA (20 мМ трис-HCl [pH 8,0], 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 0,5% твин 20). с добавлением двух коктейльных таблеток с ингибиторами протеазы (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Клетки лизировали с использованием микрофлюидизатора (Microfluidics, Newton, MA), и суспензию центрифугировали (20000 × г, , 20 мин, 4 ° C) для удаления остатков клеток.ExsA и LcrF очищали из очищенных лизатов с использованием Ni ²⁺ -аффинной хроматографии и диализовали в течение ночи при 4 ° C в буфере ExsA без имидазола с добавлением 1 мМ дитиотреитола (DTT), как описано ранее (27). Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Круговая перестановка и EMSA. Зонды для анализов круговой перестановки и методологии были выполнены, как описано ранее (27). ДНК-зонды для анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) были созданы с помощью стандартной ПЦР с использованием пар праймеров, перечисленных в таблице S5 в дополнительном материале.Конкретные промоторные зонды, содержащие сайты связывания ExsA или LcrF, имели размер ~ 200 п.н., а неспецифический зонд (160 п.н.) происходил из области промотора algD . Неспецифические части зондов, описанных на фиг. 5B, также происходили из области промотора algD . Продукты ПЦР очищали из геля с использованием метода экстракции из геля QIAquick (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Короткие промоторные зонды (~ 50 п.н.) получали отжигом комплементарных олигонуклеотидов (25 пмоль каждый), разведенных в дуплексном буфере (30 мМ HEPES [pH 7.5], 100 мМ ацетат калия; Конечный объем 50 мкл). Смесь грунтовки нагревали до 95 ° C в течение 5 мин и постепенно охлаждали до 25 ° C со скоростью 1 ° C / мин. Реакции очищали с использованием набора для удаления нуклеотидов Qiagen. Промоторные зонды метили по концам 10 мкКи [γ- ³² P] АТФ, как описано ранее (27). Реакции EMSA (20 мкл) содержали 0,06 нМ неспецифических и / или специфических зондов, 10 мкл 2х ДНК-связывающего буфера (20 мМ Трис [pH 7,5], 100 мМ KCl, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ и 10% глицерина. ), 25 нг / мкл поли (2′-дезоксиинозиновой 2′-дезоксицитидиловой кислоты) и 100 мкг / мл бычьего сывороточного альбумина.Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем добавляли ExsA или LcrF в указанных концентрациях. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин и анализировали на гелях 5% полиакриламид-глицина. Гели анализировали с помощью фосфорного сканера FLA-7000 (Fujifilm) и программного обеспечения Multigage версии 3.0 (Fujifilm).

Эксперименты по сшиванию. Очищенный LcrF заменяли буфером для сшивания (20 мМ HEPES [pH 7,9], 500 мМ NaCl, 0,5% Tween 20, 1 мМ DTT) с использованием колонок Micro Bio-Spin 6 (Bio-Rad) .Реакции перекрестного сшивания проводили в буфере для перекрестного сшивания, инкубируя LcrF (800 нМ) с указанной концентрацией Sulfo-EGS [этиленгликоль бис (сульфосукцинимидилсукцинат)], DSS (дисукцинимидил суберат) или DMP (диметилпимелимидат) в течение 60 минут. . Образцы немедленно загружали в 12% SDS-полиакриламидный гель и подвергали иммуноблоттингу с использованием поликлональной антисыворотки LcrF.

РЕЗУЛЬТАТЫ

LcrF активирует экспрессию гена T3SS у P. aeruginosa. Семейство регуляторов транскрипции AraC характеризуется наличием ДНК-связывающего домена, состоящего из двух мотивов спираль-поворот-спираль (HTH) (26).Первые спирали каждого мотива HTH (называемые спиралью узнавания) служат первичными детерминантами специфичности связывания и функции, встраиваясь в соседние большие бороздки ДНК для установления специфичных для оснований контактов с промоторной областью (44). Мы наблюдали, что аминокислотные последовательности, составляющие спирали узнавания ExsA, практически идентичны активаторам экспрессии гена T3SS (LcrF / VirF) в патогенных иерсиний (см. Рис. S1 в дополнительном материале). На основании этого наблюдения мы предположили, что LcrF / VirF распознает нуклеотидную последовательность, аналогичную консенсусному сайту связывания ExsA.Чтобы проверить эту идею, мы провели эксперимент по комплементации, введя плазмиду экспрессии LcrF (pLcrF) в мутант PA103 exsA :: Ω, несущий ExsA-зависимый P _exsC-lacZ , P _exsD-lacZ или P _exoT-lacZ транскрипционный репортер. Полученные штаммы культивировали в неиндуцирующих (с высоким содержанием Ca ²⁺ / -EGTA) и индуцирующих (низкий Ca ²⁺ / + EGTA) условиях для экспрессии гена T3SS и анализировали на активность β-галактозидазы.Как показано на фиг. 1A-C, экспрессируемые плазмидой ExsA и LcrF оба дополняли мутант exsA :: Ω для экспрессии P _exsC-lacZ , P _exsD-lacZ и P _exoT-lacZ репортеров с двумя заметными отличиями. Во-первых, LcrF-зависимая репортерная активность была значительно повышена по сравнению с ExsA-зависимой активностью. Во-вторых, в то время как активация репортеров с помощью ExsA дополнительно усиливалась, когда клетки выращивали в условиях с низким содержанием Ca ²⁺ (3-, 7- и 7-кратные для P _exsC-lacZ , P _{exsD- lacZ} и P _exoT-lacZ соответственно), активация тех же репортеров LcrF была лишь умеренно повышена в отсутствие Ca ²⁺ (1.3-, 1,4- и 1,4-кратные соответственно). Тривиальное объяснение LcrF-зависимого увеличения репортерной активности состоит в том, что стационарные уровни экспрессии LcrF повышены по сравнению с ExsA. Однако иммуноблоттинг экстрактов целых клеток с использованием очищенных LcrF и ExsA в качестве стандартов показал, что количества LcrF и ExsA аналогичны у P. aeruginosa (см. Рис. S2 в дополнительном материале).

LcrF дополняет мутант exsA по экспрессии гена T3SS. (От A до C) PA103 exsA :: Ω, несущий либо P _exoT-lacZ (A), P _exsC-lacZ (B), либо P _exsD-lacZ (C) транскрипционный репортер трансформировали векторным контролем (pJN105), вектором экспрессии ExsA (pExsA) или вектором экспрессии LcrF (pLcrF).Полученные штаммы культивировали в неиндуцирующих (-EGTA, столбцы) или индуцирующих (+ EGTA, штрихованные столбцы) условиях для экспрессии гена T3SS и анализировали на активность β-галактозидазы, как указано в единицах Миллера. *, P <0,001; ** P <0,01. (D) Окрашенный серебром гель концентрированной жидкости супернатанта культуры, приготовленной из PA103 дикого типа или штамма PA103 exsA :: Ω, несущего указанные плазмиды, после роста в неиндуцирующих (-EGTA) или индуцирующих (+ EGTA) условиях для гена T3SS выражение.Положения стандартов молекулярной массы указаны на левой стороне геля, а секретируемые белки типа III ExoU, ExoT, PopB, PopD, PopN и PcrV помечены на правой стороне геля (49).

Поскольку увеличение LcrF-зависимой репортерной активности не могло быть связано с повышенными уровнями LcrF, мы затем рассмотрели возможность того, что LcrF нечувствителен к антиактиватору ExsD. ExsD ингибирует ExsA-зависимую активацию в условиях высокого Ca ²⁺ , но в значительной степени неактивен в условиях низкого Ca ²⁺ из-за действия регуляторного каскада ExsC / ExsE (16).Следовательно, в отсутствие exsD ExsA-зависимая активация репортера P _exoT-lacZ дерепрессирована и в значительной степени нечувствительна к уровням Ca ²⁺ (рис. 1A). LcrF-зависимая активация репортера P _exoT-lacZ , однако, была сходной как в присутствии, так и в отсутствие exsD (фиг. 1A). Основываясь на этом открытии, мы заключаем, что LcrF не регулируется ExsD, что объясняет нечувствительность LcrF к уровням Ca ²⁺ .

Реглон T3SS P. aeruginosa состоит из 10 ExsA-зависимых промоторов, которые контролируют экспрессию аппарата секреции, эффекторов, шаперонов и белков-транслокаторов (45). Чтобы определить, активирует ли экспрессируемый плазмидой LcrF весь регулон T3SS, образцы культурального супернатанта собирали из клеток, выращенных в неиндуцирующих и индуцирующих условиях экспрессии гена T3SS, и подвергали SDS-PAGE и окрашиванию серебром. Как показано на фиг. 1D, экспрессия либо ExsA, либо LcrF в мутанте exsA привела к повышенной секреции эффекторов ExoU / ExoT, транслокаторов PopB / PopD / PcrV и регулятора PopN по сравнению с векторным контролем (pJN105). .Обнаружение того, что LcrF поддерживает более высокий уровень секреции, чем ExsA, согласуется с репортерными данными, представленными на фиг. 1A-C, и указывает, что LcrF активирует все 10 ExsA-зависимых промоторов.

LcrF ДНК-связывающие свойства. Затем мы сравнили ДНК-связывающие свойства ExsA и LcrF, используя анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). ExsA и LcrF были экспрессированы в виде слитых белков, меченных амино-концевым гистидином, в E. coli и очищены с помощью Ni ²⁺ -аффинной хроматографии (см.рис.S3A в дополнительном материале). Чтобы независимо подтвердить предыдущий отчет о том, что очищенный LcrF является димерным (28), мы выполнили исследования перекрестного связывания с использованием панели амино-реактивных перекрестных линкеров различной длины спейсера (DSS, DMP и Sulfo-EGS). Очищенный LcrF (с молекулярной массой 30 кДа) инкубировали со сшивающими агентами в течение 60 мин, подвергали электрофорезу на денатурирующих полиакриламидных гелях и проводили иммуноблоттинг на LcrF. В то время как инкубация LcrF либо с Sulfo-EGS (см. Рис. S3B), либо с DMP (данные не показаны) приводила к образованию большого количества сшитых частиц массой ~ 60 кДа, сшитые частицы отсутствовали в образце, содержащем только носитель (диметилсульфоксид [ДМСО]).Напротив, эксперименты по перекрестному связыванию с LcrF _m , мономерным вариантом, описанным ниже, привели только к небольшим количествам поперечно-сшитых частиц ∼60 кДа, тем самым подтверждая, что очищенный LcrF является димерным в растворе, в то время как LcrF _m в первую очередь мономерный.

EMSA проводили путем инкубации ExsA или LcrF с неспецифическим (160 п.н.) контрольным зондом, полученным из промоторной области algD , и специфическим (~ 200 п.н.) зондом, полученным из ExsA-зависимого P _exsC , P _exoT и P _exsD промоторов.Образцы подвергали электрофорезу на неденатурирующих полиакриламидных гелях и фосфорному изображению. Предыдущие исследования с ExsA показали, что промоторные области P _exsC , P _exoT и P _exsD содержат по два сайта связывания для мономерного ExsA (27, 31). Связывание с промоторами P _exoT и P _exsD происходит посредством пути сборки мономера, посредством которого один мономер ExsA связывается с сайтом 1 (что приводит к сдвигу продукта 1 на рис.2C и E), а затем рекрутирует другой мономер ExsA на второй сайт связывания (сайт 2), который расположен прямо перед сайтом 1 (представлен как продукт сдвига 2). ExsA, вероятно, связывается с промотором P _exsC также посредством сборки мономера, но происходит в высокой степени кооперативным образом, так что кинетика связывания очень быстрая, что приводит к образованию большого количества продукта сдвига 2 и лишь мимолетных количеств сдвиг продукта 1 (фиг. 2А).

ДНК-связывающие свойства очищенных ExsA и LcrF.EMSA выполняли с использованием радиоактивно меченных зондов, полученных из ExsA-зависимых промоторов P _exsC (A и B), P _exoT (C и D) и P _exsD (E и F). Неспецифический зонд (Non-Sp), полученный из промоторной области algD , был включен во все реакции связывания в качестве отрицательного контроля. Зонды (0,05 нМ каждый) инкубировали в отсутствие или в присутствии 11, 23, 45, 90, 180 или 360 нМ ExsA (A, C и E) или LcrF (B, D и F) в течение 15 мин при 25 ° С.Образцы анализировали с помощью электрофореза в природном полиакриламидном геле и фосфорного изображения. Указаны положения продуктов сдвига 1 и 2. Звездочка указывает фоновый сдвиг неспецифического зонда под действием LcrF.

В то время как связывание ExsA приводило к образованию продуктов сдвига 1 и 2, связывание LcrF приводило к единственному преобладающему продукту сдвига при связывании с P _exoT , P _exsD и P _exsC промоторные зонды (рис.2B, D и F). Комплексы с более низкой подвижностью также были очевидны с LcrF, но точная природа этих комплексов не исследовалась. По причинам, описанным ниже, преобладающие продукты сдвига, образованные LcrF, были обозначены как продукт сдвига 2. Подвижности продукта сдвига 2, образованного ExsA и LcrF, были неотличимы друг от друга при использовании промоторного зонда P _exsC (фиг. 2A и B, дорожки 8 и 9). Поскольку как изоэлектрические точки (8,6 и 9,1), так и молекулярные массы (31.6 и 30,8 кДа) ExsA и LcrF подобны, это открытие предполагает, что продукт сдвига 2 представляет две молекулы, связанные с промоторным зондом P _exsC . Однако способ образования продукта сдвига 2 отличается тем, что образование продукта сдвига 2 с помощью ExsA происходит в результате последовательного связывания двух мономеров ExsA, тогда как занятие LcrF происходит в результате связывания одного димера LcrF.

В отличие от наших результатов для промоторного зонда P _exsC , комплексы первичных промоторных зондов LcrF, наблюдаемые для P _exoT и P _exsD (продукт сдвига 2), имели меньшую подвижность по сравнению с этим продукта сдвига 2, генерируемого ExsA (рис.2C — F, дорожки 8 и 9). В предыдущем исследовании мы обнаружили, что промоторные зонды P _exsC , P _exsD и P _exoT , хотя и не изогнуты по своей природе, изгибаются при связывании с ExsA (27). Хотя ExsA и LcrF, по-видимому, изгибают промоторный зонд P _exsC до аналогичного уровня (рис. 2A и B), мы предположили, что LcrF изгибает промоторные зонды P _exoT и P _exsD , чтобы в большей степени, чем ExsA, и что это увеличение изгиба объясняет разницу в подвижности сменного элемента 2.Чтобы проверить эту идею, мы выполнили EMSA с использованием более мелких промоторных зондов длиной 50 п.н., которые, как было ранее показано, сводят на нет влияние ExsA-зависимого изгиба на подвижность из-за их меньшего размера (3). При использовании более мелких промоторных зондов P _exsC , P _exsD и P _exoT подвижности продукта сдвига 2, образованного ExsA и LcrF, были одинаковыми в каждом случае (рис. 3A-C , дорожки 3 и 7). Это открытие предполагает, что пониженная подвижность комплексов зондов промотора LcrF, наблюдаемая на рис.2 является результатом увеличения изгиба ДНК под действием LcrF по сравнению с ExsA.

Свойства изгиба ДНК ExsA и LcrF. (От A до C) EMSA с использованием радиоактивно меченных зондов длиной 50 п.н., полученных из ExsA-зависимых промоторов P _exsC (A), P _exsD (B) и P _exoT (C). Зонды (0,05 нМ каждый) инкубировали в присутствии 20, 60 или 180 нМ ExsA (дорожки 1–3 на каждой панели) или LcrF (дорожки 5–7 на каждой панели) в течение 15 минут при 25 ° C. Образцы анализировали с помощью электрофореза в природном полиакриламидном геле и фосфорного изображения.(D) Диаграмма, изображающая положение сайта связывания ExsA (черный ящик), полученного из промотора P _exsD , внутри зондов с 1 по 5 (сплошная линия). (E) Эксперимент с круговой перестановкой, выполняемый с использованием зондов с 1 по 5 (0,05 нМ каждый), инкубированных в присутствии 180 нМ ExsA (дорожки с нечетным номером) или LcrF (дорожки с четным номером) в течение 15 минут при 25 ° C. Образцы анализировали с помощью электрофореза в природном полиакриламидном геле и фосфорного изображения. Указаны положения продуктов сдвига 1 и 2.

Чтобы дополнительно подтвердить дифференциальный эффект, который ExsA и LcrF оказывают на изгиб, мы провели анализ круговой перестановки с использованием промоторного зонда P _exsD . Круговая перестановка основана на наблюдении, что электрофоретическая подвижность изогнутой ДНК сильнее замедляется, когда изгиб находится в центре фрагмента ДНК (46). Для проверки дифференциального изгиба мы использовали панель из пяти промоторных зондов P _exsD , в которых сайт связывания ExsA был расположен с равномерно распределенными интервалами по фрагменту ДНК размером ~ 200 п.н. (рис.3D). Как и ожидалось, подвижность продукта сдвига 2, образованного LcrF, была наиболее сильно замедлена, когда сайт связывания ExsA был расположен по направлению к центру зондов EMSA (рис. 3E, зонды 2–4), и замедлялась в большей степени, чем при использовании ExsA. . Эти объединенные данные демонстрируют, что ExsA и LcrF по-разному влияют на изгиб ДНК, и показывают, что эти эффекты зависят от промотора.

Данные EMSA, полученные с использованием более коротких зондов длиной 50 пар оснований (рис. 3A-C) и зондов с круговой перестановкой (рис.3E) дополнительно подтверждают вывод о том, что ExsA и LcrF связываются как мономеры и димеры, соответственно. Основным основанием для этого вывода является отсутствие продукта сдвига 1 при использовании LcrF для реакций EMSA, представленных на фиг. 3A-C и E. В то время как некоторые слабые полосы в области продукта сдвига 1 можно увидеть для LcrF на фиг. 3B. и C, те же полосы также присутствуют на дорожке, которая содержит только промоторные зонды (дорожка 4 по сравнению с дорожкой 5).

Генетические детерминанты связывания LcrF. ExsA-зависимая активация репортера P _exoT-lacZ требует двух высококонсервативных последовательностей (GnC и TGnnA), которые составляют сайт связывания 1 (рис.4А). Чтобы определить, чувствителен ли LcrF к тем же мутациям, панель мутантных репортерных штаммов P _exoT-lacZ трансформировали плазмидой экспрессии pLcrF, культивировали в условиях индукции (+ EGTA) для экспрессии гена T3SS и анализировали на β -галактозидазная активность. Подобно нашим предыдущим результатам с ExsA (27), активация репортера P _exoT-lacZ с помощью LcrF была высокочувствительной к мутациям, нарушающим основные последовательности GnC и TGnnA (рис.4Б). Замена C-39A, которая представляет собой слабо консервативное положение в консенсусной связывающей последовательности ExsA, имела промежуточный эффект на активацию LcrF. Наконец, замена C-50G, которая была включена в качестве отрицательного контроля, не влияла на активацию ExsA или LcrF.

ExsA- и LcrF-зависимая активация чувствительна к нуклеотидным заменам в консенсусном сайте ExsA. (A) Последовательность промотора P _exoT , показывающая консервативные последовательности GnC и TGnnA (выделены жирным шрифтом) и нуклеотидные замены, указанные стрелкой.(B) Штамм PA103 exsA :: Ω, несущий указанные репортеры P _exoT-lacZ , трансформировали pExsA или pLcrF. Полученные штаммы культивировали в присутствии EGTA и анализировали на активность β-галактозидазы. Активация ExsA (светлые столбцы) и LcrF (заштрихованные столбцы) представлена ​​как процент активности, нормализованный по отношению к активности репортера P _exoT-lacZ дикого типа. (C и D) EMSA с использованием радиоактивно меченных зондов, полученных из мутантных промоторов P _exoT .Неспецифический зонд P _algD (Non-Sp) был включен в качестве отрицательного контроля. Зонды (0,05 нМ каждый) инкубировали в присутствии 45 нМ ExsA (C) или LcrF (D) в течение 15 мин при 25 ° C. Образцы анализировали с помощью электрофореза в природном полиакриламидном геле и фосфорного изображения. Указаны положения продуктов сдвига 1 и 2.

Чтобы подтвердить, что дефекты активации, наблюдаемые на фиг. 4B, коррелируют со снижением связывания ДНК, мы использовали промоторные зонды, полученные из мутантных репортеров P _exoT-lacZ в EMSA.Поскольку занятие сайта связывания 2 с помощью ExsA зависит от предшествующего занятия сайта 1, мутации в сайте 1 приводят к значительному снижению образования продуктов сдвига 1 и 2 (рис. 4C) (27). Однако на связывание LcrF с теми же промоторными зондами в значительной степени не влияли замены, которые нарушают консенсусный сайт ExsA (рис. 4D). Мы предположили, что LcrF, будучи димером в растворе, может быть менее чувствительным к заменам в сайте 1, потому что дополнительные взаимодействия в сайте 2 компенсируют дефекты связывания в сайте 1.Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали мономерный вариант LcrF на основе предшествующих знаний о димеризации AraC. AraC димеризуется через антипараллельную область спиральной спирали, которая стабилизируется триадами лейцина, расположенными на каждом конце интерфейса (47). Два из предсказанных остатков триады лейцина в LcrF (L136 и L144) были заменены на аланин, и полученный белок был обозначен как LcrF _m (мономерный). LcrF _m был значительно нарушен для активации репортера P _exoT-lacZ в мутанте exsA , но стабильно экспрессировался (см.рис.S3C в дополнительном материале). LcrF _m был очищен с помощью Ni ²⁺ -аффинной хроматографии и в исследованиях сшивания был обнаружен в значительной степени мономерный (см. Фиг. S3A и B). В EMSA связывающие свойства мономерного ExsA и LcrF _m были аналогичными, что приводило к образованию продуктов сдвига 1 и 2 на промоторном зонде P _exoT (фиг. 2C и фиг. 5A, дорожки 6-10. ). Напротив, LcrF образовывал только продукт сдвига 2 (фиг. 5A, дорожки с 1 по 5).

LcrF связывается с промоторным зондом P. aeruginosa P _exoT в виде димера. (A) EMSA с использованием радиоактивно меченных зондов длиной 50 пар оснований, полученных из ExsA-зависимого промотора P _exoT . Зонды (0,05 нМ каждый) инкубировали в присутствии 12, 36, 108, 324 нМ LcrF (дорожки 2–5) или LcrF _m (дорожки 6–10) в течение 15 минут при 25 ° C. Образцы анализировали с помощью электрофореза в природном полиакриламидном геле и фосфорного изображения. (B) Диаграмма, изображающая зонды промотора P _exoT с укорочениями, которые разрушают сайты связывания 1 и / или 2.Сплошные и пунктирные линии представляют собой нативные и ненативные последовательности P _exoT соответственно. Богатая аденином область и консервативные последовательности GnC и TGnnA выделены жирным шрифтом. (C) EMSA с использованием радиоактивно меченных зондов длиной 60 пар оснований, полученных из ExsA-зависимого промотора P _exoT . Зонды (0,05 нМ каждый) инкубировали в присутствии 90 нМ ExsA (A), LcrF (F) или LcrF _m в течение 15 минут при 25 ° C. Образцы были проанализированы и отображены, как описано выше.

Хотя LcrF _m предпочтительно формирует продукт сдвига 1 на промоторе P _exoT , неясно, происходит ли оккупация в сайте связывания 1 или 2.Для дальнейшего изучения этого мы использовали панель промоторных зондов P _exoT с укорочениями, которые нарушают сайты связывания 1 и / или 2 (фиг. 5C). Длину зонда поддерживали на уровне 60 п.н. путем замены удаленных областей неспецифической ДНК. Минимальный промоторный зонд состоял из последовательностей, богатых аденином, GnC и TGnnA, и поддерживал образование продуктов сдвига 1 и 2 с помощью ExsA и LcrF _m (фиг. 5C, дорожки 1 и 3). Те же зонды ранее использовались, чтобы показать, что занятие сайта 2 ExsA зависит от присутствия сайта связывания 1 (27), и мы демонстрируем аналогичные результаты здесь для LcrF _m .Зонд 2, у которого отсутствует функциональный сайт 2, привел к полному отсутствию образования продукта сдвига 2 с помощью ExsA и LcrF _m , но по-прежнему поддерживал образование продукта сдвига 1. Напротив, связывание ExsA и LcrF _m было значительно нарушено при использовании зонды, лишенные сайта 1 (зонд 3) или сайтов 1 и 2 (зонд 4). В отличие от наших результатов для ExsA и LcrF _m , удаление сайта связывания 1 или 2 (зонд 2 и 3) оказало лишь умеренное влияние на образование продукта сдвига 2 LcrF дикого типа (рис.5C, дорожки 2, 5, 8), и только после удаления обоих сайтов (зонд 4) наблюдалось значительное снижение связывания LcrF (фиг. 5C, дорожка 11). Эти данные демонстрируют, что димерный LcrF более толерантен к заменам, которые нарушают консенсусный сайт связывания ExsA, и что LcrF _m предпочтительно связывается с сайтом 1. Установив последний пункт, мы затем спросили, был ли LcrF _m чувствителен к нуклеотидным заменам, которые нарушить консенсусный сайт связывания ExsA с помощью панели мутантных промоторных зондов P _exoT , описанных на рис.4А. В то время как на связывание нативного LcrF в значительной степени не влияли замены в консенсусной области ExsA (фиг. 4D), связывание LcrF _m было значительно снижено (фиг. 5D), демонстрируя, что консенсусный сайт связывания ExsA необходим для максимального занятия сайта 1

Консенсусный сайт связывания ExsA присутствует в LcrF-зависимых промоторах Y. pestis. Обнаружение того, что LcrF чувствителен к мутациям, нарушающим консенсусный сайт связывания ExsA, позволяет предположить, что такая же последовательность распознавания существует в иерсиний.Для дальнейшего изучения этого мы провели поиск в промоторных регионах Y. pestis P _yopN , P _lcrG , P _yscN и P _yscB и выявили почти идеальное соответствие Консенсусная связывающая последовательность ExsA в каждом промоторе (фиг. 6). Как ранее наблюдалось для ExsA-зависимых промоторов (27), консенсусная последовательность TGnnA в каждом промоторе Y. pestis была отделена от предполагаемых боксов Pribnow (TATAAT) на ~ 21–22 п.н.Это побудило нас проверить, реагируют ли транскрипционные репортеры P _yopN-lacZ , P _lcrG-lacZ и P _yscN-lacZ на ExsA. Для этих экспериментов плазмиды экспрессии ExsA и LcrF вводили в фон с двойным мутантом exsA :: Ω Δ exsD , чтобы избежать регуляции по обратной связи активности ExsA с помощью ExsD. Хотя и ExsA, и LcrF приводили к значительной активации репортеров P _yopN-lacZ , P _lcrG-lacZ и P _yscN-lacZ , LcrF-зависимая активность каждого из промоторов была значительно повышена по сравнению с ExsA-зависимой активностью (рис.7A-C).

Выравнивание последовательностей консенсусной связывающей последовательности ExsA в ExsA (Pseudomonas aeruginosa) -, LcrF (Yersinia pestis) -, PxsA (Photorhabdus luminescens) -, AxsA (Aeromonas hydrophila) — и VxsAemolypoters (Vibrio) . Сайты связывания ExsA 1 и 2 указаны стрелками. Консенсусная последовательность обозначена красным, а -10 областей подчеркнуты. Закрашенные области в промоторах P. aeruginosa P _pcrG и Y. pestis P _lcrG соответствуют областям, защищенным ExsA и LcrF / VirF от расщепления ДНКазой I, соответственно (см.рис.S5 в дополнительном материале) (31, 48).

ExsA активирует транскрипцию транскрипционных репортеров Y. pestis. (От A до C) PA103 exsA :: Ω деформация, несущая либо P _yopN-lacZ (A), P _yscN-lacZ (B), либо P _lcrG-lacZ (C) репортеры трансформировали pJN105, pExsA или pLcrF. Полученные штаммы культивировали в условиях, не индуцирующих (-EGTA, белые столбцы) или индуцирующих (+ EGTA, заштрихованные столбцы) на экспрессию гена T3SS, и анализировали на активность β-галактозидазы.Значения были указаны в единицах Миллера. (D — F) EMSA с использованием радиоактивно меченных зондов, полученных из LcrF-зависимых промоторов P _yopN (D), P _yscN (E) и P _lcrG (F). Зонд P _algD был включен во все реакции связывания в качестве неспецифического (Non-Sp) контроля. Зонды (0,05 нМ каждый) инкубировали в отсутствие (дорожка 2) или в присутствии 11, 23, 45 или 90 нМ ExsA (дорожки с 3 по 6 на каждой панели) или LcrF (дорожки с 7 по 10 на каждой панели) в течение 15 мин при 25 ° C.Образцы анализировали с помощью электрофореза в природном полиакриламидном геле и фосфорного изображения. Указаны положения продуктов сдвига 1 и 2.

Для дальнейшего изучения взаимодействия ExsA и LcrF с промоторными областями Y. pestis P _yopN , P _lcrG и P _yscN мы выполнили EMSA. Связывание ExsA с каждым промоторным зондом приводило к образованию продуктов сдвига 1 и 2 (фиг. 7D-F, дорожки 3-6). Комплексы промоторных зондов с меньшей подвижностью также были очевидны с промоторными зондами P _yopN и P _yscN при самых высоких концентрациях ExsA (рис.7D — F, дорожка 6). Эти продукты, вероятно, представляют собой неспецифические взаимодействия с ExsA. Связывание LcrF с зондами промотора Y. pestis привело только к одному преобладающему виду (продукт сдвига 2), который проявлял пониженную подвижность по сравнению с комплексами зонда ExsA-промотор (фиг. 7D-F, дорожки 5 и 8). Эти данные дополнительно подтверждают вывод, что ExsA связывается как мономер, тогда как LcrF связывается как димер, и что LcrF обладает повышенной активностью изгиба ДНК по сравнению с ExsA.

Поскольку ExsA активирует транскрипцию LcrF-зависимых промоторов, мы затем проверили, требуются ли нуклеотиды, составляющие консенсус связывания ExsA, для активации Y.pestis P _yscN промотор. Подобно нашим результатам с мутантным репортером P _exoT-lacZ на рис. 4B, мутации, которые нарушили основные сайты GnC и TGnnA в транскрипционном репортере P _yscN-lacZ , также привели к значительному снижению ExsA. — и LcrF-зависимая активность (фиг. 8A и B). Напротив, мутации, которые изменяли неконсервативные положения -50 и плохо консервативные -39, имели менее серьезные эффекты на ExsA- и LcrF-зависимую активность.

Y. pestis P _yscN Репортерная активность чувствительна к заменам, которые нарушают сайт связывания ExsA. (A) Последовательность промотора P _yscN , показывающая консенсусную последовательность ExsA в сайте связывания 1. Последовательности GnC и TGnnA выделены жирным шрифтом, а каждая нуклеотидная замена промотора указана стрелкой. (B) Штамм PA103 exsA :: Ω, несущий указанные мутантные транскрипционные репортеры P _yscN-lacZ , трансформировали либо pExsA, либо pLcrF.Полученные штаммы культивировали в присутствии EGTA и анализировали на активность β-галактозидазы. Активация pExsA (светлые столбцы) и pLcrF (заштрихованные столбцы) представлена ​​как процент активности мутантных промоторов, нормализованный к активности промотора yscN дикого типа P _.

ExsA дополняет мутант lcrF Y. pestis по экспрессии гена T3SS. Обнаружение того, что LcrF дополняет мутант exsA P. aeruginosa по экспрессии гена T3SS, привело нас к исследованию, дополняет ли ExsA ген Y.pestis lcrF мутант. Мутант с делецией lcrF был получен заменой гена в штамме, несущем транскрипционный репортер yopM :: lacZYA . Репортерные штаммы дикого типа и lcrF yopM :: lacZYA трансформировали плазмидами экспрессии pExsA и pLcrF и анализировали на репортерную активность после роста в отсутствие Ca ²⁺ . Подобно нашему открытию, что LcrF дополняет мутант exsA , ExsA смог восстановить репортерную активность yopM :: lacZYA в гене Y.pestis Δ , мутант lcrF (фиг. 9A), хотя и в меньшей степени, чем LcrF. Чтобы определить, может ли ExsA полностью активировать T3SS Y. pestis, штаммы культивировали в присутствии или в отсутствие Ca ²⁺ , разделяли на фракции клеточного лизата и супернатанта и анализировали иммуноблоттингом на YopM и YopN. Как показано на фиг. 9B, LcrF и ExsA оба дополняли мутант Δ lcrF по экспрессии и низкой Ca ²⁺ -зависимой секреции YopM и YopN. На основании этих данных мы заключаем, что ExsA дополняет Y.pestis Δ lcrF , мутант по экспрессии гена T3SS, хотя и на пониженных уровнях по сравнению с LcrF, вероятно, из-за плохой экспрессии ExsA в Y. pestis (фиг. 9B).

ExsA активирует экспрессию T3SS Y. pestis. (A) Y. pestis KIM5-3001 ( yopM :: lacZYA ) и KIM5-3233-F2 (Δ lcrF yopM :: lacZYA ), несущие векторный контроль (V), pLcrF или pExsA. культивировали в условиях, индуцирующих экспрессию гена T3SS, а затем анализировали на активность β-галактозидазы, как указано в единицах Миллера.(B) Y. pestis дикого типа KIM5-3001 (дорожки 1 и 2) или KIM5-3001-F1 (Δ lcrF ) (дорожки 3–10), не имеющий вектора (дорожки 1–4) или несущий контроль переносчика (дорожки 5 и 6), pLcrF (дорожки 7 и 8) или pExsA (дорожки 9 и 10) выращивали в условиях, не индуцирующих (+ кальций) или индуцирующих (-кальций; дорожки с нечетными номерами) для экспрессии гена T3SS. Готовили концентрированную надосадочную жидкость (S) и фракции, ассоциированные с клетками (C), и подвергали SDS-PAGE и иммуноблот-анализу. Стрелки указывают на белковые продукты.

Гомологи ExsA от других патогенов также чувствительны к заменам в промоторе P _exoT . Основные структурные компоненты T3SS P. aeruginosa, yersiniae, A. hydrophila, P. luminescens и V. parahaemolyticus кодируются в 4 высококонсервативных оперона. Основываясь на обозначениях P. aeruginosa, эти опероны состоят из popN-pcrR , pcrG-popD , pscN-pscU и exsD-pscM (см. Рис. S4 в дополнительном материале).Единственное очевидное различие в генетической организации среди пяти организмов — это оперон yersiniae yscB-yscM , в котором отсутствует exsD . Выравнивание промоторных областей, расположенных перед каждым опероном, выявило почти идеальные консенсусные сайты связывания ExsA в каждом организме (рис. 6). Нашу уверенность в выравнивании подкрепляет тот факт, что расстояние между последовательностью TGnnA и предполагаемыми блоками -10 Pribnow составляет от 20 до 22 пар оснований. Как упоминалось ранее, аналогичное расположение промежутков наблюдается во всех 10 ExsA-зависимых промоторах.Наконец, консенсус, полученный при выравнивании всех 20 промоторных областей, показанных на фиг. 6, по существу идентичен консенсусу ExsA, полученному с использованием только промоторов P. aeruginosa. На основании этих наблюдений мы проверили, чувствительны ли активаторы из A. hydrophila, P. luminescens и V. parahaemolyticus к тем же мутациям репортера P _exoT-lacZ , которые нарушают ExsA- и LcrF-зависимую активацию. Подобно ExsA и LcrF, AxsA (A. hydrophila), PxsA (P. luminescens) и VxsA (V.parahaemolyticus) были чувствительны к заменам в последовательностях GnC и TGnnA репортера P _exoT-lacZ , в то время как плохо консервативные положения -39 и неконсервативные -50 имели промежуточное влияние и не влияли на активность, соответственно (рис. 10).

Штамм PA103 exsA :: Ω, несущий указанные транскрипционные репортеры P _exoT-lacZ , трансформировали векторами экспрессии AxsA (pAxsA), PxsA (pPxsA) или VxsA (pVxsA). Полученные штаммы культивировали в присутствии EGTA и анализировали на активность β-галактозидазы.Активация pAxsA (светлые столбцы), pPxsA (заштрихованные столбцы) и pVxsA (серые столбцы) представлена ​​как процентная активность мутантных промоторов, нормализованная к активности промотора exoT дикого типа P _.

Наши первые усилия по разработке низкомолекулярных ингибиторов белков MAR начались с подхода к разработке лекарств на основе структуры. Члены семейства бактериальных регуляторов транскрипции MAR (AraC) содержат два консервативных ДНК-связывающих домена спираль-поворот-спираль (14). Опубликованные кристаллические структуры ДНК-связывающих доменов из белков MARA и Rob E. coli (26, 35) были использованы в качестве матриц «активного центра» в компьютерных исследованиях стыковки малых молекул. Эти эксперименты идентифицировали соединения класса бензимидазолов, которые «стыковались» с ДНК-связывающим доменом.Они были выбраны для последующих усилий в области медицинской химии, направленных на взаимосвязь структуры и активности (SAR). Предыдущие исследования продемонстрировали, что белки MarA, Rob и SoxS, которые выполняют перекрывающиеся роли в регуляции устойчивости к нескольким антибиотикам, агентам окислительного стресса и органическим растворителям (2), также необходимы для полной вирулентности E. coli в организме человека. модель восходящего пиелонефрита на мышах (7). Ингибиторы MAR, нацеленные на MarA, Rob и SoxS in vitro , резко снижали инфекцию почек в модели восходящего пиелонефрита (6).Основываясь на вышеупомянутых результатах, мы стремились распространить разработку ингибиторов белка MAR на инфекции, вызванные Yersinia spp.

Штаммы бактерий и их конструирование. Y. pseudotuberculosis штаммы дикого типа (WT) YPIIIpIB1 (28) и IP2666pIB1 (34) и мутантный штамм YPIII pIB1 ^— (4). Бактерии культивировали в бульоне 2 × YT (Invitrogen). Для создания штаммов Δ lcrF были использованы следующие праймеры для амплификации ДНК, фланкирующей ген lcrF с помощью ПЦР: LcrF11, 5′-GTGTGAGTCGACATGCCAGCTCAGCC-3 ‘; LcrF22, 5’-GACAGTGCATGCAGTTGGTGAGTTAT-3 ‘; LcrF3, 5’-CCAACTGCATGCACTGTCACAGGCTA-3 ‘; и LcrF4, 5’-CTGTGAGAGCTCCACCTTGTTTATCGGCAACA-3 ‘.Продукты ПЦР из пары праймеров, содержащей LcrF11 и LcrF22, и пары, содержащей LcrF3 и LcrF4, использовали в качестве матричной ДНК во втором раунде ПЦР с праймерами LcrF11 и LcrF4. Продукт ПЦР клонировали в суицидный вектор pCVD442 (13) по сайтам рестрикции SacI и SalI. Полученная плазмида pCVD442-Δ lcrF была выделена из штамма SM10 λpir E. coli и введена в штаммы Y. pseudotuberculosis YPIIIpIB1 и IP2666pIB1 путем конъюгации, как описано ранее (27).Генотипы штаммов Δ lcrF были подтверждены с помощью ПЦР.

 


Софтбол WIAC 2018


                               ПОЛОЖЕНИЕ (ОКОНЧАТЕЛЬНОЕ)

                                  WIAC в целом
     Команда W L T Pct W L T Pct
     UW-Whitewater....... 12 2 0 .857 29 13 1 .686
     УВ-Ошкош .......... 10 4 0 .714 26 14 0 .650
     UW-Стаут ............ 9 5 0 .643 23 12 0 .657
     UW-Eau Claire ....... 7 7 0 .500 21 18 0. 538
     UW-Platteville ...... 6 8 0 .429 21 15 0 .583
     Водопад УЗ-Ривер ...... 6 8 0 .429 21 15 0 .583
     UW-La Crosse ........ 5 9 0 .357 18 18 0 .500
     UW-Стивенс Пойнт .... 1 13 0 .071 12 25 0 .324
     
     


 
 

 


Софтбол WIAC 2018
Резюме лидеров WIAC ФИНАЛ
(Все игры)

КОМАНДНЫЙ БОЙ G СРЕДНИЙ AB R H 2B 3B HR BB SO SB-ATT
-------------------------------------------------- -----------------------------
Водопады У-З ... 36.328 1044 211 342 72 5 31 84 129 47-51
UW-Стаут ............ 35,316 964 184 305 63 3 21 77 149 76-87
UW-Oshkosh .......... 40 .315 1089 238 343 75 20 20 98 128 20-28
UW-Platteville ...... 36 .303 1010 176 306 57 6 14 87 135 29-39
UW-Whitewater ....... 43,298 1150 210 343 70 12 9 109 142 76-85
UW-La Crosse ........ 36. 292 985 172 288 58 2 20 69 139 32-40
UW-Eau Claire ....... 39 .281 1009 166 284 59 8 9 108 162 53-69
UW-Стивенс Пойнт .... 37 0,2620240 54 4 5 60144 43-58

Командный питчинг G ERA W L Sv IP H R ER BB SO
-------------------------------------------------- ------------------------------
UW-Whitewater ....... 43 2,15 29 13 1 277,1 223 112 85 80 260
UW-La Crosse ........ 36 2,66 18 18 4 236,2 255 127 90 74 157
UW-Platteville...... 36 2,84 21 15 4 241,2 256 127 98 102 216
UW-Eau Claire ....... 39 3,04 21 18 3 260,1 260 141 113 84 140
UW-Stout ............ 35 3,15 23 12 3 231,0 271141104 58106
УЗ-Ошкош .......... 40 3,20 26 14 5 262,2 323 163120 103 127
Водопад УЗ-Ривер ...... 36 4,28 21 15 5 235,2 307 180 144 126 151
UW-Стивенс Пойнт .... 37 4,51 12 25 5 239,0 292 200 154 96 186

ПОЛЕ КОМАНДЫ G PO A E Pct DP PB SBA-ATT
-------------------------------------------------- -------------------
UW-Whitewater....... 43 831 243 38 .966 8 6 26-32
UW-La Crosse ........ 36 707 269 40 .961 5 6 33-42
УВ-Ошкош .......... 40 788 372 52 .957 21 9 24-36
UW-Platteville ...... 36 725 308 48 .956 7 21 30-38
UW-Eau Claire ....... 39 781 292 50 .955 4 13 26-33
Водопад UW-River ... 36 707250 46 .954 8 11 37-50
UW-Стаут ............ 35 693278 53,948 8 5 39-45
UW-Стивенс Пойнт.... 37 717 282 63,941 11 23 60-71

ИНДИВИДУАЛЬНАЯ БИТВА
Мин. 2,0 AB / Командная игра G Ср. AB R H RBI 2B 3B HR BB
-------------------------------------------------- -------------------------
Мэри Илиопулос-СТ ........ 34 .500 98 35 49 14 7 2 2 8
Kyncaide Diedrich-ST ...... 26 .412 85 25 35 23 3 0 3 3
Бет Вуд-СТ .............. 34,398 108 11 43 23 15 1 1 11
Кайя Дорн-РФ.............. 32,396 101 27 40 22 9 0 5 8
Шеннон Гал-ПЛТ .......... 36,393 112 13 44 28 11 0 2 10
Эбби Жак-ПЛТ ........... 36,392 125 35 49 16 14 1 2 10
Бриттани Болдуин-ЛК ....... 36 .379 116 31 44 4 2 1 1 4
Айяна Ледвейн-РФ ......... 35 .377 130 27 49 20 11 3 1 9
Аманда Макилхани-ОШ ....... 40 0,374 107 29 40 22 6 3 4 3
Вера Пфлюградт-WW ......... 36.372 94 20 35 17 5 1 2 3
Мэллори Клотц-WW .......... 43 .371 132 33 49 34 9 2 4 17
Молли Каспар-РФ ........... 36,369 122 27 45 31 9 0 4 12
Ноэль Сенур-РФ .......... 36 .367 120 18 44 31 7 0 10 9
Эрика Берри-ОШ ........... 40,366 112 22 41 22 8 2 2 10
Сабрина Скардамагл-LC ..... 31 .365 74 12 27 15 10 1 0 12
Миа Шмидтке-LC .......... 34,364 99 26 36 33 10 0 8 10
Кейтлин Крол-ОШ.......... 40. 348 112 15 39 32 7 1 3 18
Грейс Миндруп-ЛК .......... 34 347 101 12 35 20 7 0 4 3
Акация Тупа-ОШ ........... 39. 346 107 30 37 22 9 5 4 14
Рэйчел Мартин-PLT ......... 36,346 107 23 37 26 8 1 3 11

ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ ПИТЧИНГ
Мин. 1.0 IP / командная игра Приложение ERA W-L Sv IP H R ER BB SO
-------------------------------------------------- ---------------------
Кэти Кляйн-LC............ 26 1,20 4-3 3 52,2 47 19 9 25 47
Джулия Камардо-WW .......... 23 2,04 14-6 0 123,1 100 46 36 23 116
Эштон Хёппнер-PLT ....... 26 2,28 13-8 4 135,1 132 53 44 59150
Белла Маттиас-WW ......... 19 2,34 10-5 0 101,2 80 43 34 41 107
Мэдди Студницка-РФ ....... 29 2,52 4-4 5 66,2 65 29 24 14 46
Стефани Вильчинс-ЕС ..... 23 2,56 6-2 3 68,1 71 39 25 12 33
Клэр Петрус-ОШ ......... 28 2,61 13-9 1 123,1 143 71 46 41 50
Мэдди Мюэлкен-LC......... 14 2,62 5-1 0 56,0 59 27 21 13 18
Бейли Смани-ОШ ......... 24 2,70 11-4 3 111,2 127 54 43 42 61
Сидн Шаттак-ЛК ......... 14 2,82 2-4 1 39,2 54 29 16 16 35
Мелеа Брунс-СТ ............ 16 2,83 6-4 1 64,1 79 40 26 21 22
Сара Пека-ЭК ............. 23 2,84 11-11 0 113,1 113 56 46 29 53
Эбби Бернс-PLT ............ 15 3,10 5-4 0 58,2 64 37 26 22 38
Бет Вуд-СТ .............. 23 3,12 10-4 1 103,1 117 54 46 19 52
Sommer Kunstmann-ST....... 17 3,20 5-4 1 50,1 59 37 23 16 23

ХИТЫ
----
Мэллори Клотц-WW .......... 49
Айяна Ледвейн-РФ ......... 49
Эбби Жак-ПЛТ ........... 49
Мэри Илиопулос-СТ ........ 49
Молли Каспар-РФ ........... 45

ЗАБЕГАЕТ
-----------
Кэти Ронгстад-EC ......... 37
Мэри Илиопулос-СТ ........ 35
Эбби Жак-ПЛТ ........... 35
Мэллори Клотц-WW .......... 33
Бриттани Болдуин-ЛК ....... 31

ЗАБЕГАЕТ В
--------------
Мэллори Клотц-WW.......... 34
Миа Шмидтке-LC .......... 33
Кейтлин Крол-ОШ .......... 32
Молли Каспар-РФ ........... 31
Ноэль Сенур-РФ .......... 31

ДВОЙНОЙ
-------
Бет Вуд-СТ .............. 15
Эбби Жак-ПЛТ ........... 14
Кейтлин Катино-WW ......... 13
5 равных, 11 дубль (-ов)

ТРОЙНИКИ
-------
Акация Тупа-ОШ ........... 5
Кейтлин Катино-WW ......... 4
Айяна Ледвейн-РФ ......... 3
Аманда Макилхани-OSH....... 3
11 ничья, 2 тройных (-ых)

ДОМАШНИЕ БЕГЫ
---------
Ноэль Сенур-РФ .......... 10
Миа Шмидтке-LC .......... 8
Мэдди Студницка-РФ ....... 6
Кайя Дорн-РФ .............. 5
7 ничья, 4 хоумран (-а)

ИТОГО БАЗЫ
-----------
Ноэль Сенур-РФ .......... 81
Мэллори Клотц-WW .......... 74
Эбби Жак-ПЛТ ........... 71
Миа Шмидтке-LC .......... 70
Айяна Ледвейн-РФ ......... 69

УКРАДЕННЫЕ ОСНОВАНИЯ SB-ATT
----------------------------------
Меган Швейцер-WW....... 28-31
Kyncaide Diedrich-ST ...... 24-25
Мэри Илиопулос-СТ ........ 23-24
Кейтлин Катино-WW ......... 17-17
Бриттани Болдуин-LC ....... 15-16

УДАРЫ IP SO
-------------------------------------
Эштон Хоппнер-PLT ....... 135,1 150
Джулия Камардо-WW .......... 123,1 116
Белла Матиас-WW ......... 101.2 107
Анна Палицкая-СТП .......... 105,1 94
Пэйтон Спекель-РФ ......... 88,1 72



 
 

 


Софтбол WIAC 2018
Статистика WIAC ФИНАЛ
(Все игры)



КОМАНДНЫЕ БОРЬБЫ G Ср. OBpct Slug AB R H 2B 3B HR RBI BB SO SB SBA S SF
-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----------
1.Водопад UW-River ... 36 .328 .379 .495 1044 211 342 72 5 31 197 84 129 47 51 5 7
2. UW-Stout ............ 35 .316 .372 .453 964 184 305 63 3 21 167 77 149 76 87 14 11
3. UW-Oshkosh .......... 40 .315 .386 .476 1089 238 343 75 20 20 211 98 128 20 28 30 14
4. UW-Platteville ...... 36 .303 .364 .413 1010 176 306 57 6 14 161 87 135 29 39 27 7
5. UW-Whitewater ....... 43. 298.366 .403 1150 210 343 70 12 9 178 109 142 76 85 27 6
6. UW-La Crosse ........ 36 .292 .345 .416 985 172 288 58 2 20 147 69 139 32 40 30 6
7. UW-Eau Claire ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
8. UW-Stevens Point .... 37 .262 .314 .346 917 110 240 54 4 5 92 60 144 43 58 39 1

Командный питчинг G ERA BAvg W L IP H R ER BB SO CG HR ShO SV BB / 7 SO / 7
-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- ----------------
1.UW-Whitewater ....... 43 2,15. 214 29 13 277,1 223 112 85 80 260 26 20 11 1 2,02 6,56
2. UW-La Crosse ........ 36 2,66 0,269 18 18 236,2 255 127 90 74 157 5 12 5 4 2,19 4,64
3. UW-Platteville ...... 36 2,84 0,266 21 15 241,2 256 127 98 102 216 17 1 5 4 2,95 6,26
4. UW-Eau Claire ....... 39 3,04 0,251 21 18 260,1 260 141 113 84 140 14 14 6 3 2,26 3,76
5. UW-Stout ............ 35 3,15. 285 23 12 231,0 271141104 58106 14 16 3 3 1,76 3,21
6. UW-Oshkosh .......... 40 3.20 .303 26 14 262,2 323 163 120 103 127 19 9 2 5 2,74 3,38
7. Водопад UW-River ... 36 4,28. 314 21 15 235,2 307 180 144 126 151 4 15 2 5 3,74 4,49
8. UW-Stevens Point .... 37 4,51 0,291 12 25 239,0 292 200 154 96 186 5 10 0 5 2,81 5,45

ИНДИВИДУАЛЬНАЯ БИТВА
Мин. 2.0 AB / Командная игра CL G Avg OBpct Slug AB R H 2B 3B HR RBI BB SO SB SBA S SF
-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- ---------
1. Мэри Илиопулос-СТ ........ SO 34 .500 .538 .673 98 35 49 7 2 2 14 8 5 23 24 2 0
2. Kyncaide Diedrich-ST ...... SO 26 .412 .433 .553 85 25 35 3 0 3 23 3 6 24 25 3 1
3. Бет Вуд-СТ .............. SR 34 .398 .458.583108 11 43 15 1 1 23 11 13 3 3 0 0
4. Kaia Dorn-RF .............. JR 32 .396 .441 .634 101 27 40 9 0 5 22 8 8 11 12 2 1
5. Shannon Gaul-PLT .......... FR 36 .393 .443 .545 112 13 44 11 0 2 28 10 9 0 0 1 0
6. Abby Jaques-PLT ........... JR 36 .392 .435 .568 125 35 49 14 1 2 16 10 10 11 14 2 2
7. Бриттани Болдуин-ЛК ....... SR 36 .379 .405 .440 116 31 44 2 1 1 4 4 12 15 16 6 0
8.Айяна Ледвейн-РФ ......... SR 35 .377 .417 .531 130 27 49 11 3 1 20 9 4 8 10 1 0
9. Аманда Макилхани-ОШ ....... SO 40 .374 .412 .598 107 29 40 6 3 4 22 3 20 1 4 2 0
10.Vera Pflugradt-WW ......... FR 36 .372 .404 .511 94 20 35 5 1 2 17 3 11 4 5 1 0

ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ ПИТЧИНГ
Мин. 1,0 IP / Командная игра CL G GS ERA BAvg W-L IP H R ER BB SO CG HR ShO SV BB / 7 SO / 7
-------------------------------------------------- -------------------------------------------------- -----------------
1.Кэти Кляйн-LC ............ SR 26 0 1,20,235 4-3 52,2 47 19 9 25 47 0 2 0 3 3,32 6,25
2. Джулия Камардо-WW .......... JR 23 19 2,04 .216 14-6 123,1 100 46 36 23 116 13 13 4 0 1,31 6,58
3. Ashton Hoeppner-PLT ....... FR 26 20 2,28 .249 13-8 135,1 132 53 44 59 150 17 1 4 4 3,05 7,76
4. Белла Маттиас-WW ......... SO 19 19 2.34 .213 10-5 101.2 80 43 34 41 107 12 6 3 0 2,82 7,37
5. Мэдди Студницкая-РФ....... SR 29 0 2,52 0,252 4-4 66,2 65 29 24 14 46 0 7 0 5 1,47 4,83
6. Стефани Вильчинс-ЕС ..... SO 23 8 2,56 .249 6-2 68,1 71 39 25 12 33 2 1 1 3 1,23 3,38
7. Клэр Петрус-ОШ ......... SO 28 20 2,61. 285 13-9 123,1 143 71 46 41 50 11 4 2 1 2,33 2,84
8. Мэдди Муэлкен-LC ......... FR 14 12 2,62 0,271 5-1 56,0 59 27 21 13 18 0 4 0 0 1,62 2,25
9. Бейли Смани-ОШ ......... JR 24 17 2.70,289 11-4 111,2 127 54 43 42 61 8 4 0 3 2,63 3,82
10.Сидн Шаттак-ЛК ......... FR 14 6 2,82. 312 2-4 39,2 54 29 16 16 35 0 3 0 1 2,82 6,18

 


Софтбол WIAC 2018
Статистика WIAC ФИНАЛ
(Все игры)

ХИТЫ CL G H H / G
--------------------------------------------------
1. Мэллори Клотц-WW .......... SR 43 49 1.14
   Айяна Ледвейн-РФ ......... SR 35 49 1.40
   Эбби Жак-ПЛТ ........... JR 36 49 1,36
   Мэри Илиопулос-СТ ........ SO 34 49 1,44
5. Молли Каспар-РФ ........... FR 36 45 1,25
6. Ноэль Сенур-РФ .......... SO 36 44 1.22
   Бриттани Болдуин-ЛК ....... SR 36 44 1,22
   Shannon Gaul-PLT .......... FR 36 44 1,22
9. Бет Вуд-СТ .............. SR 34 43 1,26
2 равных, 41 попаданий

ЗАБЕГАЕТ С ОЦЕНКОЙ CL G R R / G
--------------------------------------------------
1.Кэти Ронгстад-EC ......... SO 39 37 0,95
2. Мэри Илиопулос-СТ ........ SO 34 35 1.03
   Эбби Жак-ПЛТ ........... JR 36 35,97
4. Мэллори Клотц-WW .......... SR 43 33 .77
5. Бриттани Болдуин-ЛК ....... SR 36 31,86
6. Акация Тупа-ОШ ........... SO 39 30 .77
7. Аманда Макилхани-OSH ....... SO 40 29 .73
8. Меган Швейцер-WW ....... SO 39 28 .72
4 равны, забито 27 пробежек


ДОМАШНИЙ БЕГ CL G HR HR / G
--------------------------------------------------
1.Ноэль Сенур-РФ .......... SO 36 10 .28
2. Mia Schmidtke-LC .......... FR 34 8 .24
3. Мэдди Studnicka-RF ....... SR 35 6 .17
4. Кайя Дорн-РФ .............. JR 32 5 .16
7 ничья, 4 хоумран (-а)






ДВОЙНОЙ CL G 2B 2B / G
--------------------------------------------------
1. Бет Вуд-СТ .............. SR 34 15 .44
2. Эбби Жак-ПЛТ ........... JR 36 14.39
3. Кейтлин Катино-WW ......... Младший 43 13.30
4. Шеннан Борхардт-РФ ...... SR 36 11 .31
   Шеннон Гал-ПЛТ .......... FR 36 11,31
   Эмили Рукс-WW .............. JR 42 11,26
   Айяна Ледвейн-РФ ......... SR 35 11 .31
   Алисия Мейер-СТ ........... JR 31 11,35
5 равных, 10 дубль (-ов)


ТРОЙНИКИ CL G 3B 3B / G
--------------------------------------------------
1. Акация Тупа-ОШ........... SO 39 5 .13
2. Кейтлин Катино-WW ......... JR 43 4 .09
3. Айяна Ледвейн-РФ ......... SR 35 3 .09
   Аманда Макилхани-ОШ ... SO 40 3 .08
11 ничья, 2 тройных (-ых)






ЗАБЕГАЕТСЯ В КЛАССЕ G RBI RBI / G
--------------------------------------------------
1. Мэллори Клотц-WW .......... SR 43 34,79
2. Миа Шмидтке-LC .......... FR 34 33,97
3. Кейтлин Крол-ОШ.......... JR 40 32 .80
4. Ноэль Сенур-РФ .......... SO 36 31,86
   Молли Каспар-РФ ........... FR 36 31,86
6. Shannon Gaul-PLT .......... FR 36 28,78
7. Рэйчел Мартин-PLT ......... JR 36 26 .72
8. Мэдди Studnicka-RF ....... SR 35 25 .71
9. Эмили Рукс-WW .............. JR 42 24,57
5 связали с 23 ИКР

УКРАДЕННЫЕ ОСНОВАНИЯ CL G SB SB / G
--------------------------------------------------
1.Меган Швейцер-WW ....... SO 39 28 .72
2. Kyncaide Diedrich-ST ...... SO 26 24.92
3. Мэри Илиопулос-СТ ........ SO 34 23 .68
4. Кейтлин Катино-WW ......... JR 43 17,40
5. Бриттани Болдуин-ЛК ....... SR 36 15.42
6. Кэти Ронгстад-ЕС ......... SO 39 14.36
7. Лорен Люэдтке-СТП ........ FR 37 13 .35
8. Дарби Раффель -EC .......... SR 35 12 .34
9. Кайя Дорн-РФ .............. JR 32 11 .34
   Эбби Жак-ПЛТ........... JR 36 11 .31

ИТОГО БАЗЫ CL G TB TB / G
--------------------------------------------------
1. Ноэль Сенур-РФ .......... SO 36 81 2,25
2. Мэллори Клотц-WW .......... SR 43 74 1,72
3. Эбби Жак-ПЛТ ........... JR 36 71 1,97
4. Миа Шмидтке-LC .......... FR 34 70 2,06
5. Айяна Ледвейн-РФ ......... SR 35 69 1,97
6. Акация Тупа-ОШ ........... SO 39 68 1,74
7. Молли Каспар-РФ........... FR 36 66 1,83
   Мэри Илиопулос-СТ ........ SO 34 66 1,94
9. Кайя Дорн-РФ .............. JR 32 64 2,00
   Аманда Макилхани-ОШ ....... SO 40 64 1.60

ПРОГУЛКИ CL G BB BB / G
--------------------------------------------------
1. Эмили Рукс-WW .............. JR 42 20,48
2. Кейтлин Крол-ОШ .......... JR 40 18.45
3. Мэллори Клотц-WW .......... SR 43 17,40
4. Гретхен Арнесон-ЕС....... SO 34 16 .47
5. Эбби Ментинг-ОШ .......... JR 40 15.38
   Джесси Танел-ПЛТ ........... SO 34 15 .44
   Алисия Мейер-СТ ........... JR 31 15 .48
8. Акация Тупа-ОШ ........... SO 39 14 .36
   Кейтлин Катино-WW ......... JR 43 14,33
3 равных 13 ходь (ов)

БАЗОВЫЙ ПРОЦЕНТ CL G AB H BB HBP SF OB%
-------------------------------------------------- -------------
1. Мэри Илиопулос-ST........ СО 34 98 49 8 0 0. 538
2. Бет Вуд-СТ .............. SR 34 108 43 11 1 0 .458
3. Сабрина Скардамагл-LC ..... FR 31 74 27 12 3 3 .457
4. Кэти Ронгстад-ЕС ......... SO 39 119 41 11 12 0 .451
5. Мэллори Клотц-WW .......... SR 43 132 49 17 0 0 .443
6. Эрика Берри-ОШ ........... SR 40 112 41 10 7 2 .443
7. Shannon Gaul-PLT .......... FR 36 112 44 10 0 0 .443
8. Кайя Дорн-РФ .............. JR 32 101 40 8 1 1.441
9. Кейтлин Крол-ОШ .......... JR 40 112 39 18 0 1 .435
10. Эбби Жак-ПЛТ ........... JR 36 125 49 10 1 2 .435

ПРОЦЕНТ ЗАГЛУШКИ CL G AB H 2B 3B HR SLUG%
-------------------------------------------------- -------------
1. Mia Schmidtke-LC .......... FR 34 99 36 10 0 8 .707
2. Ноэль Сенур-РФ .......... SO 36 120 44 7 0 10 0,675
3. Мэри Илиопулос-СТ ........ SO 34 98 49 7 2 2 .673
4. Акация Тупа-ОШ........... SO 39 107 37 9 5 4 .636
5. Кайя Дорн-РФ .............. JR 32 101 40 9 0 5 .634
6. Аманда Макилхани-ОШ ... SO 40 107 40 6 3 4. 598
7. Бет Вуд-СТ .............. SR 34 108 43 15 1 1 .583
8. Эбби Жак-ПЛТ ........... JR 36 125 49 14 1 2 .568
9. Мэллори Клотц-WW .......... SR 43 132 49 9 2 4 .561
10.Kyncaide Diedrich-ST ...... SO 26 85 35 3 0 3 .553
 


Софтбол WIAC 2018
Статистика WIAC ФИНАЛ
(Все игры)

WINS CL G W-L
---------------------------------------------
1.Джулия Камардо-WW .......... JR 23 14-6
2. Эштон Хёппнер-PLT ....... FR 26 13-8
   Клэр Петрус-ОШ ......... SO 28 13-9
4. Бейли Смани-ОШ ......... JR 24 11-4
   Сара Пека-EC ............. SO 23 11-11
6. Бет Вуд-СТ .............. SR 23 10-4
   Белла Маттиас-WW ......... SO 19 10-5
   Пэйтон Спекель-РФ ......... JR 24 10-6
9. Ханна Стегеман-РФ ........ FR 24 7-5
   Кейтлин Хьюз-LC ......... JR 18 7-10

INNINGS PITCHED CL G IP IP / G
-------------------------------------------------- -
1.Эштон Хоппнер-PLT ....... FR 26 135,1 5,21
2. Клэр Петрус-ОШ ......... SO 28 123,1 4,40
   Джулия Камардо-WW .......... JR 23 123,1 5,36
4. Сара Пека-EC ............. SO 23 113,1 4,93
5. Бейли Смани-ОШ ......... JR 24 111,2 4,65
6. Анна Палицкая-СТП .......... FR 31 105,1 3,40
7. Бет Вуд-СТ .............. SR 23 103,1 4,49
8. Белла Матиас-WW ......... SO 19 101,2 5,35
9. Пэйтон Спекель-РФ ......... JR 24 88,1 3.68
   Кейтлин Хьюз-ЛК ......... JR 18 88,1 4,91

УДАРЫ CL G SO SO / G
-------------------------------------------------- -
1. Ashton Hoeppner-PLT ....... FR 26 150 7,76
2. Джулия Камардо-WW .......... JR 23 116 6.58
3. Белла Матиас-WW ......... SO 19 107 7.37
4. Анна Палицкая-СТП .......... FR 31 94 6,25
5. Пэйтон Спекель-РФ ......... JR 24 72 5,71
6. Эшли Коэн-STP ......... SO 31 62 5.95
7. Бейли Смани-ОШ ......... JR 24 61 3,82
8. Кейтлин Хьюз-LC ......... JR 18 57 4.52
9. Сара Пека-EC ............. SO 23 53 3,27
10. Бет Вуд-СТ .............. SR 23 52 3,52

ВНЕШНИЙ ВИД CL App GS W L Sv
-------------------------------------------------- ---
1. Анна Палицкая-СТП .......... FR 31 20 6 11 2
   Эшли Коэн-СТП .......... SO 31 13 5 8 3
3. Мэдди Студницка-РФ....... СР 29 0 4 4 5
4. Клэр Петрус-ОШ ......... SO 28 20 13 9 1
5. Кэти Кляйн-LC ............ SR 26 0 4 3 3
   Ashton Hoeppner-PLT ....... FR 26 20 13 8 4
7. Бейли Смани-ОШ ......... JR 24 17 11 4 3
   Пэйтон Спекель-РФ ......... JR 24 18 10 6 0
   Ханна Стегеман-РФ ........ FR 24 18 7 5 0
4 равных, 23 матчей (-ей)

СОХРАНЯЕТ CL G Sv
--------------------------------------------
1.Мэдди Studnicka-РФ ....... SR 29 5
2. Эштон Хёппнер-ПЛТ ....... FR 26 4
3. Эшли Коэн-СТП .......... SO 31 3
   Кэти Кляйн-LC ............ SR 26 3
   Бейли Смани-ОШ ......... JR 24 3
   Стефани Вильчинс-EC ..... SO 23 3
7. Анна Палицкая-СТП .......... FR 31 2
7 связывает с 1 сейв (-ами)



ИГРЫ НАЧАЛИСЬ CL App GS W L Sv
-------------------------------------------------- ---
1.Ashton Hoeppner-PLT ....... FR 26 20 13 8 4
   Анна Палицкая-СТП .......... FR 31 20 6 11 2
   Клэр Петрус-ОШ ......... СО 28 20 13 9 1
4. Белла Матиас-WW ......... SO 19 19 10 5 0
   Джулия Камардо-WW .......... младший 23 19 14 6 0
   Сара Пека-EC ............. SO 23 19 11 11 0
7. Ханна Стегеман-РФ ........ FR 24 18 7 5 0
   Пэйтон Спекель-РФ ......... JR 24 18 10 6 0
   Кейтлин Хьюз-LC ......... JR 18 18 7 10 0
2 ничья, 17 начатых игр

ШУТАУТЫ CL G ShO
--------------------------------------------
1. Эштон Хёппнер-PLT ....... FR 26 4
   Джулия Камардо-WW .......... младший 23 4
3. Белла Матиас-WW ......... SO 19 3
   Сара Пека-EC ............. SO 23 3
5. Кейтлин Хьюз-LC ......... JR 18 2
   Клэр Петрус-ОШ ......... SO 28 2
5 ничья, 1 закрытие (-и)




ПОЛНЫЕ ИГРЫ CL App GS CG W L
-------------------------------------------------- ---
1.Ashton Hoeppner-PLT ....... FR 26 20 17 13 8
2. Джулия Камардо-WW .......... младший 23 19 13 14 6
3. Белла Матиас-WW ......... SO 19 19 12 10 5
4. Клэр Петрус-ОШ ......... SO 28 20 11 13 9
5. Сара Пека-EC ............. SO 23 19 9 11 11
   Бет Вуд-СТ .............. SR 23 17 9 10 4
7. Бейли Смани-ОШ ......... JR 24 17 8 11 4
8. Кейтлин Хьюз-LC ......... JR 18 18 5 7 10
9. Пэйтон Спекель-РФ ......... JR 24 18 4 10 6
2 связывает с 3 полными играми

OPP. СРЕДНЕЕ СРЕДНЕЕ CL G AB H AVG.
-------------------------------------------------- ---
1. Белла Маттиас-WW ......... SO 19 375 80 .213
2. Джулия Камардо-WW .......... JR 23 464 100 .216
3. Кэти Кляйн-LC ............ SR 26 200 47 .235
4. Ashton Hoeppner-PLT ....... FR 26 530 132 .249
5. Стефани Вильчинс-ЕС ..... SO 23 285 71 .249
6. Мэдди Студницка-РФ....... SR 29 258 65 .252
7. Сара Пека-EC ............. SO 23 442 113 .256
8. Анна Палицкая-СТП .......... FR 31 424 109 .257
9. Cheyenne Johnson-EC ....... SO 14 233 61 .262
10.Caitlyn Hughes-LC ......... JR 18 358 95 .265

ПОЛЯ КОМАНДЫ PO A E Pct DP SBA-ATT
-------------------------------------------------- ---------
1. UW-Whitewater ....... 831 243 38 .966 8 26-32
2. UW-La Crosse ........ 707 269 40.961 5 33-42
3. UW-Oshkosh .......... 788 372 52 .957 21 24-36
4. UW-Platteville ...... 725 308 48 .956 7 30-38
5. UW-Eau Claire ... 781 292 50 .955 4 26-33
6. Водопад У-Ривер ...... 707 250 46. 954 8 37-50
7. UW-Stout ............ 693 278 53 .948 8 39-45
8. UW-Stevens Point .... 717 282 63 .

No related posts.