Гк рф ст 237: Статья 237 ГК РФ. Обращение взыскания на имущество по обязательствам собственника

Содержание

Статья 237 ГК РФ. Обращение взыскания на имущество по обязательствам собственника

Статья 237 ГК РФ. Обращение взыскания на имущество по обязательствам собственника

Актуально на:

24 мая 2021 г.

Гражданский кодекс, N 51-ФЗ | ст. 237 ГК РФ

1. Изъятие имущества путем обращения взыскания на него по обязательствам собственника производится на основании решения суда, если иной порядок обращения взыскания не предусмотрен законом или договором.

2. Право собственности на имущество, на которое обращается взыскание, прекращается у собственника с момента возникновения права собственности на изъятое имущество у лица, к которому переходит это имущество.

Постоянная ссылка на документ

  • URL
  • HTML
  • BB-код
  • Текст

URL документа [скопировать]

<a href=»»></a>

HTML-код ссылки для вставки на страницу сайта [скопировать]

[url=][/url]

BB-код ссылки для форумов и блогов [скопировать]

в виде обычного текста для соцсетей и пр. [скопировать]

Скачать документ в формате

Судебная практика по статье 237 ГК РФ:

Изменения документа

Постоянная ссылка на документ

  • URL
  • HTML
  • BB-код
  • Текст

URL документа [скопировать]

<a href=»»></a>

HTML-код ссылки для вставки на страницу сайта [скопировать]

[url=][/url]

BB-код ссылки для форумов и блогов [скопировать]

в виде обычного текста для соцсетей и пр. [скопировать]

Скачать документ в формате

Составить подборку

Анализ текста

Идет загрузка…

Ст. 237 ГК РФ. Обращение взыскания на имущество по обязательствам собственника

1. Изъятие имущества путем обращения взыскания на него по обязательствам собственника производится на основании решения суда, если иной порядок обращения взыскания не предусмотрен законом или договором.

2. Право собственности на имущество, на которое обращается взыскание, прекращается у собственника с момента возникновения права собственности на изъятое имущество у лица, к которому переходит это имущество.

См. все связанные документы >>>

1. Пункт 1 комментируемой статьи устанавливает общее правило, согласно которому обращения взыскания на имущество должника с целью удовлетворения требований кредиторов осуществляется на основании решения суда. Понятие обязательства в контексте данной статьи не ограничивается только обязательствами гражданско-правового характера (ст. 307 ГК). Принудительное исполнение судебных актов, актов других органов и должностных лиц осуществляется в соответствии с ФЗ от 2 октября 2007 г. N 229-ФЗ «Об исполнительном производстве», ФЗ от 21 июля 1997 г. N 118-ФЗ «О судебных приставах».

2. В качестве исключения из общего правила о судебном порядке обращения взыскания, в случаях, предусмотренных законом или договором, может быть установлен внесудебный порядок изъятия имущества (например, соглашением сторон может быть установлен внесудебный порядок обращения взыскания на заложенное имущество (п.

1 ст. 349 ГК). Основы законодательства Российской Федерации о нотариате, утв. ВС РФ 11 февраля 1993 г. N 4462-1, устанавливают основания и условия совершения исполнительной надписи нотариуса (ст. ст. 90, 91) для осуществления взыскания в бесспорном порядке.

3. Пункт 2 комментируемой статьи устанавливает, что право собственности при обращении взыскания прекращается у должника с момента приобретения права собственности на имущество иным лицом. Момент прекращения права собственности имеет существенное значение для выяснения момента прекращения прав и обязанностей собственника в отношении имущества и его приращений (плодов, продукции, доходов). При переходе права собственности на недвижимость требуется государственная регистрация соответствующего права (ст. 131 ГК). Соответственно, права на имущество собственника, у которого имущество изымается, прекращаются с момента государственной регистрации прав нового собственника на указанное имущество.

В ТК РФ должен быть установлен срок на подачу иска о компенсации морального вреда за нарушение трудовых прав

Один из экспертов указала, что сложившаяся ситуация может говорить не столько о несовершенстве самого ТК РФ, сколько о пробелах и проблемах смежных законодательств и – что еще важнее – о проблемах соотнесения разных норм права друг с другом.

Вторая посчитала, что постановление затронуло весьма необычный для практики вопрос применения статьи – возможность расчета срока на обращение в суд за взысканием морального вреда не с момента нарушения права, а с момента, когда такое нарушение установлено судом.

Конституционный Суд вынес Постановление № 35-П от 14 июля, в котором признал ч. 1 ст. 392 Трудового кодекса не соответствующей Конституции в связи с отсутствием в ней срока обращения в суд с требованием о компенсации морального вреда, причиненного нарушением трудовых (служебных) прав, в случаях, когда требование о компенсации морального вреда заявлено в суд после вступления в законную силу решения суда, которым нарушенные трудовые (служебные) права восстановлены полностью или частично.

Повод для обращения в КС

31 июля 2013 г. Рамазан Четыз заключил с Управлением ФСИН России по Республике Саха (Якутия) контракт о службе в уголовно-исполнительной системе РФ в должности среднего начальствующего состава на пятилетний срок с момента окончания учебного заведения и был зачислен курсантом 1 курса юридического факультета ФКОУ ВО «Академия права и управления Федеральной службы исполнения наказаний».

Приказом начальника Академии ФСИН России от 4 августа 2017 г. на основании заключения служебной проверки Рамазан Четыз был отчислен из образовательной организации за грубое нарушение служебной дисциплины, снят со всех видов довольствия и приказом врио начальника республиканского УФСИН откомандирован в распоряжение ФКУ СИЗО-1 УФСИН России по Республике Саха (Якутия) с 14 августа 2017 г. Далее он был откомандирован в распоряжение начальника УФСИН России по Республике Адыгея для дальнейшего прохождения службы с 25 августа 2017 г.

15 января 2018 г. Советский районный суд г. Рязани по иску Рамазана Четыза признал приказ об отчислении незаконным. Рязанский областной суд оставил решение первой инстанции в силе. Мужчину восстановили в должности курсанта юридического факультета академии.

Решение суда было обращено к немедленному исполнению, и приказом начальника Академии ФСИН России Рамазан Четыз был восстановлен в должности курсанта 4 курса юридического факультета с 15 августа 2017 г. Соответственно, он был исключен из списков личного состава УФСИН России по Республике Адыгея и откомандирован для дальнейшего прохождения службы в распоряжение Академии ФСИН России, а по окончании обучения направлен в УФСИН России по Республике Саха (Якутия).

21 августа 2018 г. Рамазан Четыз обратился в Советский районный суд г. Рязани с исковым заявлением о компенсации морального вреда, причиненного в результате незаконного отчисления из академии. Свои требования он обосновал наличием решения суда по служебному спору, вступившего в законную силу 4 июля 2018 г. Четыз также сослался на положения ст. 237 ТК РФ, предусматривающей, что моральный вред, причиненный работнику неправомерными действиями или бездействием работодателя, возмещается работнику в денежной форме в размерах, определяемых соглашением сторон трудового договора, а в случае возникновения спора факт причинения работнику морального вреда и размеры его возмещения определяются судом независимо от подлежащего возмещению имущественного ущерба, а также на положения ст. 151 ГК РФ, закрепляющей право граждан на компенсацию морального вреда

В ходе судебного разбирательства ответчик заявил о пропуске истцом срока обращения в суд. Суд, указав, что законодательство, регулирующее отношения в сфере службы в органах уголовно-исполнительной системы, не содержит норм о компенсации морального вреда, причиненного сотруднику, посчитал возможным применить положения ч. 1 ст. 392 Трудового кодекса и определил, что предусмотренный ею трехмесячный срок обращения в суд исчисляется со дня, когда истец узнал или должен был узнать о нарушении своего права, то есть со дня издания приказа об отчислении – 4 августа 2017 г. Следовательно, соответствующий срок истек 4 ноября 2017 г. Довод представителя истца о том, что срок должен исчисляться со дня вступления в законную силу решения суда о восстановлении истца на службе, то есть с 4 июля 2018 г., суд признал несостоятельным

Решением Советского районного суда г. Рязани, оставленным без изменения апелляцией, в удовлетворении требований Рамазана Четыза было отказано в связи с пропуском срока обращения в суд. Определением судьи Рязанского областного суда от 21 июня 2019 г. было отказано в передаче кассационной жалобы для рассмотрения в судебном заседании.

Рамазан Четыз обратился в Конституционный Суд. По его мнению, ч. 1 ст. 392 ТК РФ не соответствует Конституции, поскольку выступает в качестве основания для отказа в удовлетворении требования о компенсации морального вреда, причиненного гражданину незаконными решениями, действиями (бездействием) органов государственной власти, органов местного самоуправления, должностных лиц, государственных или муниципальных служащих, в тех случаях, когда сам факт нарушения прав и свобод гражданина установлен другим решением суда, вступившим в законную силу, в связи с пропуском закрепленного этой нормой трехмесячного срока на обращение в суд.

Что сказал Конституционный Суд


КС заметил, что, согласно представленным материалам, причинение морального вреда заявитель связывает не с незаконными действиями (бездействием) органов государственной власти, органов местного самоуправления, должностных лиц, государственных или муниципальных служащих, а с незаконным отчислением из академии, которая органом государственной власти или местного самоуправления не является и с которой заявитель состоял в служебных отношениях. Соответственно, удовлетворение его требования о восстановлении в должности курсанта Академии ФСИН России происходило в рамках служебного спора, рассматривавшегося с применением ч. 1 ст. 392 Трудового кодекса.

Суд указал, что положения данной статьи послужили образцом (моделью) для осуществления правового регулирования рассмотрения и разрешения служебных споров. Так, в соответствии с ч. 4 ст. 74 Закона о службе в уголовно-исполнительной системе и о внесении изменений в Закон об учреждениях и органах, исполняющих уголовные наказания в виде лишения свободы сотрудник или гражданин, поступающий на службу в уголовно-исполнительной системе либо ранее состоявший на соответствующей службе, для разрешения служебного спора может обратиться к руководителю федерального органа уголовно-исполнительной системы или уполномоченному руководителю либо в суд в течение трех месяцев со дня, когда он узнал или должен был узнать о нарушении своего права, а для разрешения служебного спора, связанного с увольнением со службы в уголовно-исполнительной системе, – в течение одного месяца со дня ознакомления с приказом об увольнении. Такое же правило установлено ч. 4 ст. 72 Закона о службе в органах внутренних дел и внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации.

КС указал, что в тех же случаях, когда сроки обращения в суд специальным законодательством не установлены, в силу общего правила о субсидиарном применении норм трудового законодательства к отношениям, не урегулированным нормами законодательства о государственной службе, подлежат применению нормы ст. 392 Трудового кодекса. В частности, сроки обращения в суд не были установлены Положением о службе в органах внутренних дел Российской Федерации (утверждено Постановлением Верховного Совета Российской Федерации от 23 декабря 1992 г. № 4202-I), в связи с чем к отношениям с участием лиц, на которых распространялось действие названного Положения, включая сотрудников Федеральной службы исполнения наказаний, применялась упомянутая статья ТК РФ.

«С учетом изложенного предметом рассмотрения Конституционного Суда Российской Федерации по настоящему делу является часть первая статьи 392 Трудового кодекса Российской Федерации в той мере, в какой она служит основанием для исчисления срока обращения в суд с иском о компенсации морального вреда, причиненного нарушением трудовых (служебных) прав, в тех случаях, когда такой иск заявлен после вступления в законную силу решения суда по трудовому (служебному) спору, которым были восстановлены трудовые (служебные) права истца», – резюмировал Суд.

КС РФ сослался на свое Постановление от 8 июня 2015 г. № 14-П, в котором он отметил, что в случаях, когда требование о компенсации морального вреда вытекает из нарушения имущественных или иных прав, именно заинтересованному лицу в силу присущего гражданскому судопроизводству принципа диспозитивности принадлежит право выбирать, обращаться ли ему в суд с соответствующим иском одновременно с требованием о защите нарушенных прав или по отдельности (ст. 3, 131 и 151 ГПК). Суд вправе рассмотреть самостоятельно предъявленный иск о компенсации причиненных истцу нравственных или физических страданий (п. 9 Постановления Пленума ВС «Некоторые вопросы применения законодательства о компенсации морального вреда» от 20 декабря 1994 г.).

«Следовательно, работник (государственный служащий) не лишен возможности обращаться в суд с таким иском уже после разрешения судом индивидуального трудового (служебного) спора, в том числе и после вступления в законную силу решения суда, которым требование работника (государственного служащего) о восстановлении нарушенных трудовых (служебных) прав было удовлетворено», – заметил КС.

Конституционный Суд указал, что, когда требования о восстановлении нарушенных трудовых прав и о компенсации причиненного таким нарушением морального вреда заявляются работником (государственным служащим) раздельно, применение к последним сроков, предусмотренных ст. 392 ТК РФ, с учетом правил их исчисления фактически может привести к тому, что на момент вступления в законную силу судебного решения, установившего факт нарушения прав работника (государственного служащего) и, соответственно, свидетельствующего о правомерности предъявления требования о возмещении морального вреда, удовлетворение этого требования станет невозможным.

В то же время, заметил КС, в Постановлении № 14-П Суд указал, что компенсация морального вреда как самостоятельный способ защиты гражданских прав есть мера гражданско-правовой ответственности, правовая природа которой является единой независимо от того, в какой сфере отношений – публично-правовой или частноправовой – причиняется такой вред. Сам же по себе иск о компенсации морального вреда относится к требованиям о защите личных неимущественных прав и других нематериальных благ. Из этой правовой позиции следует, что к требованию о компенсации морального вреда, когда оно заявлено самостоятельно – без связи с другими требованиями, вытекающими из трудовых правоотношений, – не могут быть применены сроки, предусмотренные ч. 1 ст. 392 Трудового кодекса.

«Вместе с тем в таких случаях нельзя игнорировать неразрывную связь требования о возмещении морального вреда вследствие неправомерных действий или бездействия работодателя с трудовыми правоотношениями, что подтверждается и волей законодателя, отнесшего возмещение морального вреда, причиненного работнику, к материальной ответственности работодателя перед работником (глава 38 Трудового кодекса Российской Федерации), т.е. включившего его в сферу регулирования трудовых отношений, признав тем самым в рамках своей дискреции возможность применения в случаях предъявления соответствующих требований в связи с нарушением трудовых прав норм именно этой отрасли права, притом что в согласно статье 208 ГК Российской Федерации на требования о защите личных неимущественных прав и других нематериальных благ исковая давность не распространяется, кроме случаев, предусмотренных законом», – подчеркнул Конституционный Суд.

КС отметил, что предоставление работнику права требовать компенсации морального вреда, причиненного неправомерными действиями или бездействием работодателя, будучи направленным на достижение социально необходимого результата, не должно нарушать баланс прав и законных интересов работников и работодателей. По его мнению, реализация такого права без установления разумных сроков обращения в суд, тем более после того, как нарушенные трудовые права восстановлены в судебном порядке, вела бы к несоразмерному ограничению прав работодателя как стороны в трудовом договоре и субъекта экономической деятельности.

Таким образом, указал Суд, на законодательном уровне предполагается наличие разумных сроков обращения в суд с требованием о компенсации морального вреда, причиненного нарушением трудовых прав, в том числе после их восстановления решением суда. Это в полной мере относится и к случаям нарушения служебных прав, если законодательством, регулирующим соответствующие служебные отношения, предусматривается субсидиарное применение норм Трудового кодекса.

«В отсутствие же таких сроков правовое регулирование характеризуется имеющим конституционную значимость пробелом, в силу которого практически невозможно компенсировать моральный вред, причиненный нарушением трудовых (служебных) прав, после того, как факт такого нарушения признан судебным решением, а сами права восстановлены, без нарушения баланса прав и законных интересов сторон трудовых отношений, необходимость поддержания которого обусловлена конституционными требованиями», – отметил Суд.

Следовательно, посчитал он, правовым регулированием не обеспечивается действенная защита нарушенных трудовых (служебных) прав в части возмещения причиненного таким нарушением морального вреда, что вступает в противоречие как с конституционными предписаниями о гарантированности судебной защиты, так и с положениями международных актов, обязывающими государство обеспечить любому лицу, права и свободы которого нарушены, эффективные средства правовой защиты (ст. 2 Международного пакта о гражданских и политических правах).

Таким образом, КС РФ признал ч. 1 ст. 392 Трудового кодекса не соответствующей Конституции в той мере, в какой она не содержит указания на сроки обращения в суд с требованием о компенсации морального вреда, причиненного нарушением трудовых (служебных) прав, в тех случаях, когда требование о компенсации морального вреда заявлено в суд после вступления в законную силу решения суда, которым нарушенные трудовые (служебные) права восстановлены полностью или частично.

Суд постановил федеральному законодателю внести в действующее правовое регулирование изменения, до внесения которых требование о компенсации морального вреда, причиненного нарушением трудовых (служебных) прав, может быть заявлено одновременно с требованием о восстановлении нарушенных трудовых прав с соблюдением сроков, предусмотренных ч. 1 ст. 392 ТК РФ, либо в течение трехмесячного срока с момента вступления в законную силу решения суда, которым эти права были восстановлены полностью или частично. КС указал, что решения по делу Рамазана Четыза должны быть пересмотрены.

Эксперты назвали ситуацию нетипичной


Партнер и руководитель практики «Трудовое право» фирмы INTELLECT Анна Устюшенко назвала ст. 392 ТК РФ одной из самых спорных статей Кодекса, что связано с установленными в ней ограниченными сроками на обращение в суд за защитой трудовых прав. «Причем если логика всего Трудового кодекса указывает на необходимость охраны трудовых прав работника, то ст. 392 ТК РФ ей противоречит, устанавливая именно для работника беспрецедентно короткие сроки (по спорам об увольнении – месяц)», – заметила она.

Анна Устюшенко посчитала, что постановление затронуло весьма необычный для практики вопрос применения статьи – возможность расчета срока на обращение в суд за взысканием морального вреда не с момента нарушения права, а с момента, когда такое нарушение установлено судом. «Справедливо ли это? На мой взгляд, да, если руководствоваться общими принципами права и не затрагивать строго юридическую природу морального вреда в трудоправовом смысле, где моральный вред – ответственность работодателя», – указала эксперт.

Она отметила, что для практики рассмотрение такого аспекта применения ст. 392 ТК РФ – редкий казус. Обычно требование о возмещении морального вреда включается в один ряд с другими требованиями работника, а предметом отдельного рассмотрения является только в том случае, если иные материально-правовые требования работника удовлетворяются работодателем в досудебном порядке.

«Полагаю, что новая редакция ст. 392 ТК, с одной стороны, предоставит работникам больше гарантий по сравнению с теми, что на данный момент включены в Кодекс. Думаю, что такое отдельное, вынесенное за скобки основного спора судебное разбирательство позитивно скажется на размере взыскиваемого судами морального вреда (на сегодня он катастрофически мал). С другой стороны, возможность обращения с отдельным иском создаст дополнительную нагрузку на судебную систему, особенно если практика покажет положительную динамику по увеличению взыскиваемых сумм морального вреда при отдельном обращении», – резюмировала Анна Устюшенко.

Управляющий партнер юридической фирмы BLS Елена Кожемякина заметила, что само применение ст. 392 ТК РФ в судах встречается достаточно часто, но обычно речь о трудовых отношениях в чистом виде и конкретных событиях, от которых можно считать срок для подачи иска. 

Елена Кожемякина предположила, что сложившаяся ситуация может говорить не столько о несовершенстве самого ТК РФ, сколько о пробелах и проблемах смежных законодательств и – что еще важнее – о проблемах соотнесения разных норм права друг с другом. «Яркий пример – отсутствие указания на моральный вред в законодательстве о службе в системе исполнения наказаний», – отметила она. 

По мнению эксперта, в данном случае надо либо дополнять и модернизировать специализированные законы (законы о службе в системе исполнения наказаний, о государственной службе и т.д.), которые де факто все равно регулируют трудовые отношения, либо все жестко и четко подчинять именно ТК РФ и двум базовым понятиям: работодатель и работник.

Правовые консультации. Официальный портал Администрации города Омска

Омичи могут получить бесплатные юридические консультации

14 января 2021 года, 11:00

Совместительство как вид трудовой деятельности

15 июня 2020 года, 16:19

Ведение электронных трудовых книжек

11 июня 2020 года, 20:25

Компенсация морального вреда

09 июня 2020 года, 17:37

Оформление трудовых отношений в период простоя

06 июня 2020 года, 14:15

Гарантии для многодетных матерей при сокращении штата сотрудников

06 июня 2020 года, 13:52

Порядок сноса, обрезки и восстановления зеленых насаждений

06 июня 2020 года, 12:37

Способы замены временно отсутствующего сотрудника

06 июня 2020 года, 12:17

Меры административного воздействия на владельцев собак

06 июня 2020 года, 11:48

Порядок заключения брачного договора во время брака

06 июня 2020 года, 11:15

Оплата труда за период нерабочих дней

09 апреля 2020 года, 13:16

О курении в общественных местах

11 марта 2020 года, 11:50

О порядке расчета платы за ОДН

20 февраля 2020 года, 17:39

Об ответственности управляющей компании за непредоставление информации о деятельности

12 февраля 2020 года, 9:00

О порядке расчетов за вывоз мусора

10 апреля 2019 года, 10:17

Правовая помощь жителям оказывается во всех администрациях округов города

28 января 2019 года, 16:03

Расчет компенсации при увольнении

10 декабря 2018 года, 14:49

Вступление в наследство

10 декабря 2018 года, 14:45

Плата провайдеров за общедомовое имущество

10 декабря 2018 года, 14:43

Договор дарения и правовые последствия его заключения

07 декабря 2018 года, 14:48

Следующий

Туры и отдых в Турции, России, Вьетнаме , Таиланде, Греции, Испании, на Кипре, Индии, Индонезии, Китае, Тунисе, ОАЭ, Израиле, Иордании, Марокко, Мексике, на Кубе, Мальдивах, Доминикане, Андорре от туроператора ПЕГАС Туристик

Туры и отдых в Турции, России, Вьетнаме , Таиланде, Греции, Испании, на Кипре, Индии, Индонезии, Китае, Тунисе, ОАЭ, Израиле, Иордании, Марокко, Мексике, на Кубе, Мальдивах, Доминикане, Андорре от туроператора ПЕГАС Туристик | Пегас Туристик Новости
  • 21. 05.2021 Правила перебронирования от 21.05.2021
  • 18.05.2021 Тунис: важная информация для российских граждан, планирующих пребывание в стране
  • 11.05.2021 Кипр: важная информация для российских граждан, планирующим пребывание в стране
  • 02.05.2021 О новых правилах для прибывающих на территорию Российской Федерации
  • 26.04.2021 Египет: важная информация для российских граждан, планирующих пребывание в стране
  • 22.04.2021 Правила перебронирования от 13.04.2021
  • 21.04.2021 Роспотребнадзор вводит двойной ПЦР-тест для возвращающихся из-за границы
  • 13. 04.2021 Турция, Танзания: временное ограничение авиасообщения
  • 09.04.2021 Отдыхай сейчас – плати потом! Туры в рассрочку без переплат.
  • 09.04.2021 Куба: важная информация для российских граждан, планирующих пребывание в стране
  • 08.04.2021 Армения: важная информация для российских граждан, планирующим пребывание в стране
  • 31.03.2021 Раннее бронирование и скидки продолжаются.
  • 31.03.2021 ОАЭ Дубай: важная информация для российских граждан, планирующим пребывание в стране.
  • 31.03.2021 Новая концепция Pegas Select
  • 17. 03.2021 Акция CASHBACK Ростуризм
  • 16.03.2021 Сербия: важная информация для российских граждан, планирующим пребывание в стране
  • 11.03.2021 Стамбул: важно знать по прибытии
  • 11.03.2021 Турция: важная информация для российских граждан, планирующих пребывание в стране
  • 30.12.2020 Важно! Список средств размещений РФ, требующих медицинские справки при заселении
  • 17.12.2020 Курортный сбор в Краснодарском крае с 01.01.2021
  • 06.05.2021 Поздравляем с Днем Победы!
  • 20.03.2021 Розыгрыш. Дарим тур в восточную сказку!
  • 05.03.2021 Поздравляем с праздником весны и красоты!
  • 28.02.2021 Правила перебронирования с 01.03.2021
  • 24.02.2021 Розыгрыш. Полет к мечте.
Бортовой журнал PEGAS

Фабрика Тортов

Публичная оферта

1. Общие положения
1.1. Индивидуальный предприниматель Сбитнева Наталья Николаевна, действующий на основании свидетельства о регистрации №315632400000375, далее «Продавец», публикует Публичную оферту о продаже товаров по образцам, представленным на официальном интернет-сайте Продавца http://www.fktort.ru.
1.2. В соответствии со статьей 437 Гражданского Кодекса Российской Федерации (ГК РФ) данный документ является публичной офертой, и в случае принятия изложенных ниже условий физическое лицо, производящее акцепт этой оферты, осуществляет оплату Товара Продавца в соответствии с условиями настоящего Договора. В соответствии с пунктом 3 статьи 438 ГК РФ, оплата Товара Покупателем является акцептом оферты, что считается равносильным заключению Договора на условиях, изложенных в оферте.
1.3. На основании вышеизложенного, внимательно ознакомьтесь с текстом публичной оферты, и если вы не согласны с каким-либо пунктом оферты, Вам предлагается отказаться от покупки Товаров или использования Услуг, предоставляемых Продавцом.
1.4. В настоящей оферте, если контекст не требует иного, нижеприведенные термины имеют следующие значения:
1.5. «Оферта» – публичное предложение Продавца, адресованное любому физическому лицу (гражданину), заключить с ним договор купли-продажи (далее – «Договор») на существующих условиях, содержащихся в Договоре, включая все его приложения.
1.6. «Покупатель» – физическое лицо, заключившее с Продавцом Договор на условиях, содержащихся в Договоре.
1.7. «Акцепт» – полное и безоговорочное принятие Покупателем условий Договора.
1.8. «Товар» – перечень наименований ассортимента, представленный на официальном интернет-сайте, такие как фото торты, фото пирожные, фото зефир, фото печенье и маффины.
1.9. «Характеристика товара» — свойство конкретного наименования ассортимента представленного на официальном интернет-сайте, такие как вес, состав, количество порций одного набора.
1.10. «Заказ» – отдельные позиции из ассортиментного перечня Товара, указанные Покупателем при оформлении заявки на интернет-сайте или через Оператора.
1.11. «Доставка» – услуги по доставке Заказа.
2. Предмет договора
2.1. Продавец продает Товар в соответствии с действующим прейскурантом, опубликованным на интернет-сайте Продавца http://www.fktort.ru, а Покупатель производит оплату и принимает Товар в соответствии с условиями настоящего Договора.
2.2. Настоящий Договор и приложения к нему являются официальными документами Продавца и неотъемлемой частью оферты.
3. Оформление Заказа
3.1. Заказ Товара осуществляется Покупателем через Интернет-сайт http://www.fktort.ru.
3.2. При оформлении Заказа на интернет-сайте Продавца Покупатель обязуется предоставить следующую регистрационную информацию о себе:
3. 2.1. фамилия, имя, отчество;
3.2.2. фактический адрес доставки;
3.2.3. адрес электронной почты;
3.2.4. контактный телефон.
3.3. При оформлении Заказа через Оператора Покупатель обязуется предоставить информацию, указанную в п. 3.2. настоящего Договора. Принятие Покупателем условий настоящего Договора осуществляется посредством внесения Покупателем соответствующих данных в регистрационную форму на Интернет-сайте или при оформлении Заказа через Оператора. Покупатель имеет право редактировать регистрационную информацию о себе. Оператор не изменяет и не редактирует регистрационную информацию о Покупателе без согласия последнего. Продавец обязуется не сообщать данные Покупателя, указанные при регистрации на сайте http://www.fktort.ru при оформлении Заказа, лицам, не имеющим отношения к исполнению Заказа. Утвердив Заказ выбранного Товара, Покупатель предоставляет Оператору необходимую информацию в соответствии с порядком, указанном в п. 3.2. настоящего Договора.
3. 4. Продавец и Оператор не несут ответственности за содержание и достоверность информации, предоставленной Покупателем при оформлении Заказа.
3.5. Покупатель несёт ответственность за достоверность предоставленной информации при оформлении Заказа.
3.6. Оплата Покупателем самостоятельно оформленного на интернет-сайте Заказа означает согласие Покупателя с условиями настоящего Договора. День оплаты Заказа является датой заключения Договора купли-продажи между Продавцом и Покупателем.
3.7. Все информационные материалы, представленные на сайте http://www.fktort.ru, носят справочный характер и не могут в полной мере передавать достоверную информацию об определенных свойствах и характеристиках Товара. В случае возникновения у Покупателя вопросов, касающихся свойств и характеристик Товара, перед оформлением Заказа ему необходимо обратиться за консультацией к Оператору.
4. Сроки исполнения Заказа
4.1. Срок исполнения Заказа зависит от наличия заказанных позиций Товара на складе Продавца и времени, необходимого на обработку Заказа. Срок исполнения Заказа в исключительных случаях может быть оговорен с Покупателем индивидуально в зависимости от характеристик и количества заказанного Товара. В случае отсутствия части Заказа на складе Продавца, в том числе по причинам, не зависящим от последнего, Продавец вправе аннулировать указанный Товар из Заказа Покупателя. Продавец обязуется уведомить Покупателя об изменении комплектности его Заказа через Оператора.
4.2. Заказ считается доставленным в момент его передачи Покупателю. Подписываясь в товарной накладной, Покупатель подтверждает исполнение Заказа.
4.3. В случае предоставления Покупателем недостоверной информации его контактных данных Продавец за ненадлежащее исполнение Заказа ответственности не несет.
5. Оплата Заказа
5.1. Оплата Заказа осуществляется путем передачи Покупателем денежных средств посредством электронного денежного перевода. Подтверждением оплаты исполненного Заказа является списание денежных средств с электронного счета Покупателя.
5.2. Цены на любые позиции Товара, указанные на интернет-сайте http://www.fktort.ru, могут быть изменены Продавцом в одностороннем порядке без уведомления Покупателя.
5.3. В случае изменения цены на заказанные позиции Товара, Оператор обязуется в кратчайшие сроки проинформировать Покупателя о таком изменении. Покупатель вправе подтвердить либо аннулировать Заказ.
5.4. Условия на заказы с доставкой указаны на интернет-сайте http://www.fktort.ru в разделе «Доставка».
5.5. Стоимость Товаров с индивидуальными Характеристиками, заказанными через Оператора посредством Электронной почты или по Телефону, рассчитываются индивидуально по каждому Заказу, в зависимости от предоставленных Покупателем Характеристик товара.
5.6. Денежные средства принимаются следующим способом: безналичным платежом.
6. Доставка Товара
6.1. Обязанность Продавца по поставке Товара с условием о его доставке считается выполненной с момента подписания Покупателем товаросопроводительных документов
6. 2. Право собственности на Товар и риски случайного повреждения и/или гибели Товара переходят на Покупателя с момента фактической передачи Товара и подписания им товаросопроводительных документов при доставке Товара Покупателю.
6.3. Стоимость доставки и условия указаны на сайте компании http://www.fktort.ru.
7. Возврат Заказа
7.1. В соответствии с п. 4. ст. 26.1. Закона РФ № 2300-I «О Защите прав потребителей», Покупатель вправе отказаться от заказанного Товара в любое время до момента исполнения Заказа.
7.2. Покупатель вправе возвратить Товар в следующих случаях:
7.2.1. при совершении ошибочного перевода через платежные системы.
7.2. Для возврата денежных средств, зачисленных на расчетный счет Продавца ошибочно, посредством платежных систем, Покупатель должен обратиться в Службу поддержки с письменным заявлением с приложением копии паспорта и чеков/квитанций, подтверждающих ошибочное зачисление. Данное заявление необходимо направить по адресу: Тольятти, г. Коммунальная ул. 39. В случае возникновения вопросов, свяжитесь с Службой поддержки любым удобным для Вас способом: тел.(8482) 37-88-07 , e-mail: [email protected] . После получения письменного заявления с приложением копии паспорта и чеков/квитанций, Представитель производит возврат в срок до 10 (десяти) рабочих дней со дня получения Заявления на расчетный счет Покупателя, указанный последним в своем заявлении. При этом Продавец вправе удерживать часть суммы перечисления в счет компенсации фактически понесенных расходов. Для возврата денежных средств на банковскую карту Заказчику необходимо заполнить «Заявление о возврате денежных средств», которое высылается по требованию Компанией на электронный адрес Заказчика, и оправить его вместе с приложением копии паспорта по адресу:Тольятти, г. Коммунальная, ул. 39. Возврат денежных средств будет осуществлен на банковский счет Заказчика, указанный в заявлении, в течение 10 (Десяти) рабочих дней со дня получения «Заявление о возврате денежных средств» Компанией. Срок рассмотрения Заявления и возврата денежных средств Покупателю начинает исчисляться с момента получения Продавцом Заявления и рассчитывается в рабочих днях без учета праздников/выходных дней. Если заявление поступило Продавцу после 18.00 рабочего дня или в праздничный/выходной день, моментом получения Продавцом Заявления считается следующий рабочий день.
7.3. Покупатель не вправе отказаться от оплаченного Товара (или его части) надлежащего качества, имеющего индивидуально определённые свойства.
8. Авторские права
8.1. Вся текстовая информация и графические изображения, размещенные на интернет-сайте http://www.fktort.ru, являются собственностью Продавца и производителя Товара.
9. Права, обязанности и ответственность
9.1. Продавец не несет ответственности за ненадлежащее использование товаров Покупателем, заказанных на интернет-сайте или через Оператора.
9.2. Продавец вправе передавать свои права и обязанности по исполнению Заказов третьим лицам.
9.3. Продавец имеет право на осуществление записи телефонных переговоров с Покупателем. В соответствии с п. 4 ст. 16 Федерального закона «Об информации, информационных технологиях и о защите информации» Продавец обязуется: предотвращать попытки несанкционированного доступа к информации и/или передачу ее лицам, не имеющим непосредственного отношения к исполнению Заказов; своевременно обнаруживать и пресекать такие факты. Телефонные разговоры записываются в целях осуществления контроля деятельности Оператора и контроля качества исполнения Заказов.
9.4. Право собственности на Заказ, а также риск его случайной гибели или повреждения переходят к Покупателю с момента передачи денежных средств сотруднику Доставки или подписания товаросопроводительных документов “Покупателем”.
9.5. Все претензии по ненадлежащему исполнению заказа Покупатель вправе направить на адрес электронной почты, указанный на интернет-сайте http://www.fktort.ru в разделе “Контакты” или отправить письмо администрации в разделе “Задать вопрос”. Вся поступившая информация обрабатывается в кратчайшие сроки.
Реквизиты Продавца:
Продавец: ИП Сбинева Наталья Николаевна
Юридический адрес: 445043, Самарская область, г. Тольятти, ул. Коммунальная, д. 39
Фактический адрес: 445043, Самарская область, г. Тольятти, ул. Коммунальная, д. 39
ИНН 632207729448 ОГРН 315632400000375
ОКАТО 36440368000 ОКТМО 36740000001
Р/с 40802810811190002507
Филиал № 6318 ВТБ 24 (ПАО) г. Самара
БИК 043602955 К/с 30101810700000000955

У меня возникли вопросы по поводу оплаты

Вы можете обратиться к нам через Интернет, по e-mail [email protected] или в любое время суток по телефону +7 495 983 3279.

Что необходимо сделать, чтобы оплатить товары через Platron?

Для оплаты товаров и услуг с помощью нашей системы регистрация не нужна! Просто выберите товар и оплатите выставленный счет любым удобным способом. Результат авторизации будет передан в интернет-магазин автоматически.

Как оплатить?

В нашей системе доступны следующие способы оплаты:

·         банковские карты (VISA, MasterCard, American Express)

·         платежные терминалы (к нам подключены все основные терминальные сети, включая QIWI, Элекснет)

·         салоны связи Евросеть (инструкция по оплате Европлат), Связной

·         электронные деньги (QIWI кошелек, Яндекс.Деньги, WebMoney, PayPal)

·         оплата с баланса мобильного телефона Билайн, МТС, Мегафон, TELE2

·         оплата через интернет-банкинг Альфа-Клик, Промсвязьбанк, ВТБ24, Сбербанк ОнЛ@йн

Зачем нужен мой номер телефона?

Ваш номер телефона — это идентификатор в нашей системе. Он указывается при оплате в пунктах приема платежей, а также используется для идентификации заказа службой поддержки.

Что такое счет?

Для оплаты через систему Platron Интернет-магазин формирует электронный счет, в котором указывается сумма заказа и обоснование платежа (например «Билеты на поезд «Москва-Сочи» на 12. 06″ или «Заказ №089168»). Счет привязан к номеру телефона, который указывался при оформлении заказа.

Безопасность

Оплачивать товары и услуги с помощью Platron абсолютно безопасно. При оплате информация передается в зашифрованном виде по протоколу TLS и сохраняются только на специализированном сервере платежной системы. Таким образом, интернет-магазин не имеет доступа к Вашим платежным данным.

Сколько это стоит?

Наши услуги уже включены в стоимость заказа — на странице оплаты Вы всегда видите финальную сумму.

Я совершил оплату — как мне проверить, прошел платеж или нет?

Нажмите на ссылку Покупателям, введите номер телефона и сумму платежа, нажмите «Проверить платеж»

 

Thermit строительные материалы (термит)

Торговый дом «ТЕРМИТ» является эксклюзивным представителем завода THERMIT, работающим только с юридическими лицами и индивидуальными предпринимателями.

Теплоизоляционные плиты THERMIT XPS, строительные плиты THERMIT SP, сэндвич-панели THERMIT S всегда есть в наличии в Торговом доме «ТЕРМИТ». Для строительства, утепления и отделки помещений в наличии максимальный ассортимент продукции из экструдированного пенополистирола.

Для получения дополнительной информации Вы можете обратиться в офис Торгового дома «ТЕРМИТ» по тел. (391) 277-0-277 и 277-0-255.

Или напишите нам письмо с Вашим вопросом: [email protected]

Частные лица могут купить продукцию завода в магазинах строительных материалов. Уточнить, где находится ближайший к Вам магазин, продающий THERMIT, можно у менеджеров компании по телефонам (391) 277-0-277 и 277-0-255.

Магазины строительных материалов, где можно купить продукцию THERMIT:

 

Красноярск

Леруа Мерлен

Красноярск, ул. 9 мая, 77, ст.1

+7 (391) 257-05-45,

Красноярск, пр. Газеты им. Красноярский рабочий, 27, ст. 146

+7 (391) 270-97-07

leroymerlin.ru

«Аквамарин»

Красноярск, ул. Затонская, 18, оф. 6

тел.(391) 254–85–73

«АнгараРесурс»

Красноярск, ул. 60 лет Октября, 136, оф. 8

тел.(391) 235-99-13, 201-59-45

«ВЕЛЕС»

Красноярск, ул. Брянская, 280/4

тел. (391) 272-29-01, 266-20-85

Магазин «Стройцентр»

Красноярск, ул.Авиаторов, 50

тел.(391) 277-81-72

Компания «ДЖЕМ»

Красноярск, ул.Северное шоссе, 31а

тел. 252-53-95

Магазин «Хозтовары»

Красноярск, ул. Наклонная, 16а

тел.(391) 266-87-07

«ДЕДАЛ»А, сеть магазинов

г. Красноярск ул. Водопьянова, 11

(391) 212-88-77

г.Красноярск, ул. Воронова, 24

(391) 277-26-78, 253-42-25

Красноярск, ул.78-й Добровольческой бригады 1

(391) 277-56-46, 255-79-04

«Пилон», сеть магазинов

Красноярск, ул.Стадионная, д.1

(391) 226-42-26

Красноярск, ул.Гладкова, 6

(391) 269-56-95

Красноярск, ул. Дубровинского, 54

(391) 265-28-55

(391) 259-05-00

Красноярск, ул.Юшкова, 8

(391) 290-60-60

(391) 246-66-52

Красноярск, ул.Калинина, 171

(391) 268-33-14

Красноярск, ул.Водопьянова, 16

(391) 256-83-83

База стройматериалов «СТРОЙБЫТ» (ИП Мансуров З.К.)

г. Красноярск, ул. Дудинская, д.2

(391) 258-52-62, 258-54-61

Красноярск, ул. Гагарина, 105

(391) 2-008-009

Красноярск, ул. Армейская, 3

(391) 232-08-26, 204-02-21, 258-99-92

База-магазин «Аксиома» (ООО «СП-Трейд»)

Красноярск, ул. Академика Вавилова, 1г

(391) 236-46-15

База стройматериалов «Авиатор» (ООО «Пилот»)

Красноярск, ул. Авиаторов, 2а

(391) 258-70-80

ООО «Центр строительных технологий»

Красноярск, ул. Мате Залки, 41, оф. 1.3

www.цст24.рф, [email protected]

(391) 277-22-32

ИП Холодков

ул. Калинина

[email protected]

(391) 268-30-57

Магазин «Аквилон»

ул. Грунтовая, д. 28 А

[email protected]

(391) 260-97-97

ООО «Профит»

ул. Молокова 68

[email protected]

(391) 223-33-33

ООО «Центркомплектстрой»

ул Калинина 82

(391) 274-65-50

«ЧЕМПИОН» сеть магазинов отделочных материалов

Красноярск, ул. Тамбовская, 25

(391) 2-006-591

Красноярск, ул. Юности, 18

(391) 262-90-42

Красноярск, ул. Калинина, 64

(391) 258-95-95

Красноярск, Северное шоссе, 5г

(391) 290-21-11

ООО «ККС»

Красноярск, ул Калинина, 73а/2

(391) 288-76-00, 2010-92-90, 201-93-91

ООО «СпецКомплекс»

Красноярск, ул. Мичурина, 75

(391) 237-66-37, 237-63-16

Красноярск, ул.Авиаторов, 1 стр.2

(391) 241-30-24

ООО «Новый Дом»

Красноярск, Северное шоссе, 7г

(391) 288-57-99, 288-27-89

ООО «Гениальный подрядчик»

Красноярск, 2-я Брянская, 59/6

(391) 241-99-35, 226-86-77

«СибТеплоКомплект»

Красноярск, Северное шоссе, 11

(391) 266-25-24, 266-25-10

«Строительный сезон»

Красноярск, ул.Калинина, 43

(391) 232-91-42, 22-66-336

«СтройТеплоМаркет»

Красноярск, ул. Калинина, 73г-103

(391) 291-18-22, 291-18-23

Магазин «Вираж»

Красноярск, ул. Североенисейская, 40

(391) 290-20-01, 290-20-02

Красноярск, ул. Маерчака, 104, ст.4

(391) 221-32-10, 220-50-10

ИП Янаев

г.Красноярск, ул.Свердловская, д.15

(391) 261-55-62

ОАО «КрасноярскСтройОптТорг»

Красноярск, ул.Давыдова, 37

(391) 264-93-98

(391) 264-97-87

(391) 264-89-60

«Партнер-Строй»

Красноярск, ул.Калинина, 63г/4

(391) 268-30-57

(391) 268-30-92

Красноярск, ул.Свердловская, 140

(391) 269-83-74

Красноярск, ул.Караульная, 13, стр.2

(391) 295-89-86

Магазин «Озеро»

Красноярск, ул.Вильского, 22

(391) 298-25-00

«Город мастеров», сеть магазинов

Красноярск, ул. Затонская, д. 20 «а»

(391) 241-68-16

Красноярск, ул. Авиаторов, д. 7″в»

(391) 241-94-25

ООО «Стройтехснаб»

Красноярск, Северное шоссе, 17д , стр.21

(391) 299-76-15, 299-76-16, 299-76-17, 299-76-39

База стройматериалов «Строительный Двор» (ИП Беляев К.С.)

Красноярск, ул. Авиаторов, 7

(391) 242-42-21, 241-08-02, 252-07-00

ООО «Гарант-Мастер»

ул. Взлетная, д. 28, офис 1-04

[email protected]

(391) 292-55-18; 288-32-96

ООО «Кровельный Мир»

ул. Александра Матросова, д. 30т, офис 303, 3 этаж

[email protected]

(391) 235-05-05; 235-06-05; 217-888-5

 

Железногорск

«Пилон»

г. Железногорск, ул. Свердлова, 46

(3919) 72-79-91

(3919) 75-23-88

 

Сосновоборск

ИП Пустошилов П.Н. (м-н «Универсал»)

662501, г. Сосновоборск, ул. Ленинского Комсомола, дом № 28

(39131) 3-15-02

 

Терентьево

ИП Попков Г.В.

662518, п. Терентьево, ул. Поповича, дом № 38а

 

Зеленогорск

«Пилон»

г. Зеленогорск, Майское шоссе, 25а

(39169) 2-80-23

 

Канск

ИП Джегет «Центр СОМ»

ул. 40 лет Октября, д. 60, стр. 2, пом. 3

(39161) 29-777

ИП Мавшенко

ул. Горького, 41

[email protected], [email protected]

(39161) 3-41-92

 

Шарыпово

ООО «Идея»

662311, г. Шарыпово, ул. Индустриальная, дом № 6

[email protected]

(39153) 2-81-25

 

Шира

Магазин «Центр Кровли и Фасада»

с. Шира, ул. Курортная, дом № 72

+7-913-548-3030

 

Саяногорск

Магазин «Кровельный центр»

Республика Хакасия, г.Саяногорск, ул.Транспортная, 7 В

+7-(39042)-2-76-90, +7-913-052-3030 

Компания «ДЖЕМ»

Республика Хакасия, г.Саяногорск, ул.Металлургов,25 А

+7-(39042)-2-76-30

Минусинск

Магазин «Вектор»

г. Минусинск, ул. Чайковского, дом № 74

+7-923-218-34-99, +7-913-057-5050

 

Компания «ДЖЕМ»

г. Минусинск, ул. Свердлова, дом № 36а

+7-983-376-95-44

Аскиз

Магазин «Центр Кровли и Фасада»

Руспублика Хакасия, Аскизский р-он, с. Аскиз, ул. Переулок Третий Российский, дом № 29

+7-913-541-3000

 

Абакан

ТД «ТеплоБум»

г. Абакан, ул. Советская, 203

[email protected]

+7 (913) 050-63-43 

Компания «ДЖЕМ»

г. Абакан, ул. Ленина, 216 В

г. Абакан, ул. Буденного, 116

+7 (3902) 30-55-55

Магазин «Центр Кровли и Фасада»

г. Абакан, ул. Итыгина, 21

+7 (3902) 34-15-72, +7-913-444-0707 

Магазин «Роскровля»

г. Абакан, ул. Заводская, 6

+7 (3902) 28-58-37, +7-913-545-0101, +7-913-549-2020

Магазин «Сибирские Фасады»

г. Абакан, ул. Пушкина, 211

+7 (3902) 340-100 +7-913-053-1010

Лесосибирск

ООО «Базис»

662540, г. Лесосибирск, ул. Коммунально-складская зона 11-1

[email protected]

(39145) 5-15-09

 

Курагино

Магазин «Центр Кровли и Фасада»

Красноярский край, п.Курагино, 74 км трассы Минусинск-Артемовск

+7-913-051-1010

 

Томск

ЗАО «Бест Керамикс»

634028, г. Томск, ул. Тимакова, дом № 21, стр. 1

[email protected]

(3822) 416-333, 418-331

 

Улан-Удэ

ТГ СМИТ

[email protected]

(3012) 29-78-00

 

Братск

ГК «Десятка» (магазин Стройдвор)

пр. Индустриальный, 3a

(3953) 40-80-72, 44-81-84

 

Кемерово

Леруа Мерлен

Кемерово, Ленинградский проспект, 28Б

8 (3842) 49-02-26

leroymerlin.ru

 

Новосибирск

ООО «Гектор»

630015, Новосибирск, ул. Николая Островского, 195

8 (383) 279-86-47

630124, Новосибирск, ул. Волочаевская, 64, к1

8 (383) 256-11-11

www.gektor-nsk.ru, [email protected]

 

ООО «ХАМАМ»

Новосибирск, ул. Кропоткина, 126/1

8 (383) 292-98-39

[email protected]

http://hamam54.ru

 

ООО «БАРК-2»

Новосибирск, ул. Иванова, д. 17

www.bark2.ru, [email protected]

Леруа Мерлен

Новосибирск, ул.Ватутина, 107

8 (383) 230-12-40

leroymerlin.ru

Новосибирск, переулок Фабричный, 11

8 (383) 211-95-20

leroymerlin.ru

 

 

Новокузнецк

«Аверс Стройбаза»

г. Новокузнецк, ул. Производственная, 21

(3843) 200-325, 33-66-44, 8-902-759-66-44

[email protected]

http://averscb.ru/

Леруа Мерлен

Новокузнецк, ул. Хлебозаводская, 23

(3843) 91-04-66

leroymerlin.ru

 

 

Иркутск

ООО «ТеплоМаркет-Иркутск»

официальный дилер

www.teplomarket-irk.ru

ул. Воронежская, д. 2, стр. 6

[email protected]

(3952) 48-00-17

ЗАО «ТОН-М»

www.ton-m.ru

(3952) 34-65-98

ГК «Десятка»

ул. Трактовая, д. 18Б

(3952) 780-480

ООО «ТеплоТрейд»

ул. Трактовая, д.7 А

[email protected]

(3953) 76-86-52

ООО «Термит Центр»

www.termit-centr.ru

(3952) 740-933

Торговая компания «Партнер»

www.partner-irk.ru

(3952) 23-52-99

Сибирский Бизнес

ул. Сергеева, д. 3, стр. 15

[email protected]

(3952) 70-62-80

ГК «Капитель»

ул. Старокузьмихинская, д. 41/2

[email protected]

(3952) 42-10-16

 

 

Екатеринбург

 

 

Барнаул

Магазин «СтройМаркет»

Барнаул, ул. Попова, 258д

(3852) 465-104

Леруа Мерлен

Барнаул, Павловский тракт, 192А

(3852) 29-62-90

leroymerlin.ru

 

 

Чита

База «Стройлайн»

Забайкальский Край, г. Чита, пос. Антипиха, ул. Казачья, 11

stroyline-chita.ru, [email protected]

(3022) 339160, 339158, 339161, 339159

Стройка «Красной Звезды»

Забайкальский Край, г. Чита, ул. Красной Звезды, 7б

stroyline-chita.ru

(3022) 200501, 200502

Стройка «Краснодонская»

Забайкальский Край, г. Чита, ул. Краснодонская, 16 (напротив «Паровоза»)

stroyline-chita.ru

(3022) 208273, 208274, 208275

 

 

Москва

ООО «СтройПанельГрупп»

г. Москва, ул. Флотская, 5, корп. 2

www.bauplatte.ru, [email protected]

(495) 998-97-91, +7 926 404 0238
+7 925 290 3789

  



 

 

СТ-237

ST-237 похож на ST-5C, но с большей ПЗС-матрицей и меньшими пикселями, что приводит к более высокому разрешению при аналогичных фокусных расстояниях. Камера использует параллельный интерфейс с ПК, поэтому для работы с этой камерой у вас должен быть компьютер со стандартным параллельным портом. Система ST-237 состоит из головки камеры, блока ЦП, источника питания, параллельного кабеля и кабеля слежения. Упакован в футляр Doskocil с кубиками из поролона. Примечание. На фотографиях слева и ниже показана головка камеры с прикрепленным дополнительным штативом.Блок штатива не входит в комплект этой бывшей в употреблении камеры. Цена этого предмета составляет 295 долларов США.

Состояние: бывшее в употреблении, отличное состояние

ST-237 Camera

В 1996 году Celestron и SBIG объявили о своем первом совместном усилии: системе видеонаблюдения «Pixcel 255» CCD. В 1998 году Celestron и базирующаяся в Калифорнии компания Santa Barbara Instruments Group (SBIG) объявили о другом совместном эволюционном проекте: системе CCD-камеры Pixcel 237. Эта камера была задумана, а затем собрана для новичков — из-за простоты настройки и эксплуатации средний новичок может настроить и сделать свое первое изображение менее чем за 30 минут! Позднее камера получила название SBIG Model ST-237.Он по-прежнему совместим с инновационными телескопами Celestron «Fastar».

Камера ST-237 также разработана для опытных пользователей ПЗС-матриц, которые ищут широкий спектральный отклик и высокое разрешение, хорошо подходящие для получения изображений Луны, планет, Солнца и чудес глубокого неба. Основные улучшения по сравнению с предыдущей моделью (продаваемой как Celestron Pixcel 255) заключаются в том, что у ST-237 площадь детектора в 2,17 раза больше, чем у 255, а его пиксели на 55% меньше (по площади), что позволяет получать изображения с более высоким разрешением. мелких деталей.

ST-237 — это многоцелевой прибор, включающий детектор TC-237 производства Texas Instruments; это отличается превосходной квантовой эффективностью и широким спектральным откликом. TC-237 устанавливается на подставку поверх термоэлектрического охладителя внутри корпуса камеры. В головке также находится аналого-цифровой преобразователь, охлаждающая электроника и вентилятор, а также другая считывающая электроника. Благодаря двойной коррелированной выборке изображения, предоставляемые камерами ST-237, показывают очень хорошую детализацию и динамический диапазон (оттенки серого или цвета при использовании с дополнительным колесом фильтров / магазином).

Камера ST-237 даже при работе с дополнительным внутренним колесом фильтров совместима с системами со светосилой f2. Он покажет спиральную структуру в сотнях галактик с выдержкой от 1 до 5 минут в главном фокусе телескопа 8 дюймов f10. С таким телескопом возможна звездная фотометрия вплоть до 18-й величины. Планетарные туманности, кометы, астероиды становятся легкими целями. . Многие из этих изображений можно получить, не выходя из загородного двора. Коллекцию изображений ST-237 одного пользователя (не связанных с этой продажей) можно увидеть здесь:

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СИСТЕМЫ ПЗС МОДЕЛИ ST-237 ДЕТЕКТОР
Разрешение изображения: 640 x 480 пикселей, TI 255 CCD
Размеры пикселей изображения: 7.4 x 7,4 мкм
Размеры матрицы формирования изображений: 4,7 мм x 3,6 мм
Anti-Blooming Да

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭЛЕКТРОНИКИ ST-237
Переменная биннинга / выбирается программно
Вариабельность биннинга 1 x 1, 2 x 2 или 3 x
Шум при считывании -): 15 RMS, двойная коррелированная выборка
Темновой ток <1e- / пиксель / сек при -5 градусов C

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ST-237
Осушитель: Да, внутренний
Стандартное программное обеспечение управления: ПК DOS, Windows (все версии с поддержкой параллельного порта)
Коммуникационный порт: быстрый параллельный
Время загрузки, полный кадр: менее 12 секунд.
Затвор: электромеханический
Самая быстрая выдержка: 0,01 сек.
Максимальная выдержка: 1 час
Охлаждение от окружающей среды: -35 градусов Цельсия
Требования к питанию: 115 В.А.С. Предусмотрено (возможно 12 v.d.c.)

СЕРТИФИКАЦИЯ НА РАССМОТРЕНИИ

генов | Бесплатный полнотекстовый | Генетические механизмы астмы и последствия для репозиции лекарств

4. Репозиционирование лекарств на основе генетики

В клинической практике лекарственная терапия по-прежнему является наиболее эффективным средством предотвращения обострений и лечения астмы.Лекарства от астмы в основном делятся на два типа, а именно, бронходилататоры (например, агонисты β2-адренорецепторов, холинолитики и теофиллиновые препараты) и противовоспалительные препараты (например, глюкокортикоиды, противоаллергические препараты и лейкотриены). Несмотря на то, что на рынке представлены различные лекарства от астмы, существует большое количество пациентов с астмой, и существующие лекарства не работают у значительной части людей, страдающих астмой, что свидетельствует о необходимости разработки новых лекарств. Текущее финансирование исследований и разработок лекарственных средств увеличивается с развитием технологий высокопроизводительного секвенирования.Однако эффективность исследований и разработок новых лекарств представляет собой серьезную проблему. В этой статье мы используем основанный на генетике метод репозиции лекарств для поиска новых лекарств, которые могут иметь потенциально терапевтический эффект для пациентов с астмой [6,113]. Гены, чувствительные к болезням, являются важным источником мишеней для лекарств [2]. Однако не все гены, чувствительные к астме, являются подходящими мишенями для лекарств. Гены, которые сильно коррелируют с фенотипами заболевания и о которых сообщалось в многочисленных исследованиях, называются главными генами, что означает, что эти гены имеют более высокую вероятность в качестве мишеней для лекарств [106].Согласно соответствующим обзорам [13,19], мы собрали 34 гена, которые были отмечены в более чем пяти связанных исследованиях как главные гены. Мы считали, что эти гены более подвержены воздействию лекарств, чем другие. Кроме того, мишени для одобренных лекарств от астмы должны иметь более сильную корреляцию между генами и заболеванием, а также могут использоваться для репозиции лекарств. Обычно идеальная мишень содержит ряд функциональных аллелей, связанных с фенотипами заболевания, что может привести к потере функции LOF) или усиление функции (GOF) генов, которое вызывается определенными генетическими вариантами [114, 115].LOF или GOF генов могут приводить к приступам астмы, а агонисты или антагонисты, нацеленные на эти гены, являются потенциальными терапевтическими агентами [6,113] соответственно. Таким образом, понимание механизмов действия лекарств и патогенеза генетических заболеваний помогает нам находить новые противоастматические препараты, основанные на генетике. Как показано в Таблице 2, многие обычно одобренные лекарства от астмы соответствуют этим критериям соответствия целевым лекарствам, демонстрируя осуществимость этого метода для открытия противоастматических лекарств.Объединив информацию о главных генах астмы, генах, способных воздействовать на астму, и способах действия лекарств, мы обнаружили несколько потенциальных противоастматических препаратов из лекарств от других заболеваний, которые не были одобрены для лечения астмы (Таблица 3). Генетика астмы и гены, связанные с астмой, являются основой репозиции лекарств, и мы также объединили ее с фенотипом астмы, чтобы повысить эффективность репозиции лекарств и обеспечить руководство для лечения астмы. репозиционирование лекарства, и мы также объединили их с ролью этих мишеней в патогенезе астмы и фенотипе астмы, чтобы повысить эффективность репозиции лекарства и предоставить рекомендации по лечению астмы.Цитокины играют важную роль в воспалительной реакции при астме. Следовательно, препараты, нацеленные на цитокины, были горячими точками для разработки новых противоастматических препаратов, что позволило по-новому взглянуть на персонализированную медицину для различных фенотипов астмы [14]. Например, было несколько одобренных биологических препаратов, нацеленных на цитокины, для лечения астмы, Меполизумаб, Омализумаб, Резлизумаб [132]. При астме легкой и средней степени тяжести Т-хелперные клетки типа 2 (Th3) доминировали над клонами Т-клеток в дыхательных путях, которые являлись продуцентами цитокинов типа II IL4 и IL13, которые имели высокий уровень сообщения и белка у пациентов с астмой [133 ].Интерлейкин IL4 участвует в дифференцировке клеток Th3 и подавляет развитие клеток Т-хелперов 1-го типа (Th2), а также способствует привлечению эозинофилов и синтезу IgE [133]. IL13 способствовал выработке IgE, высвобождению хемоаттрактантов эозинофилов и увеличению секреции слизи, что вызывало сокращение гладких мышц бронхов и эпителиальный фиброз. Это привело к возникновению гиперреактивности дыхательных путей, которая сыграла решающую роль в патологических особенностях астмы [133, 134].И IL4, и IL13 играют важную роль в патологии астмы, как правило, у пациентов с воспалением профиля Th3. Ингибиторы, нацеленные на IL4RA, потенциально могут блокировать сигнальный путь IL4 / IL13. Комбинированный подход к ослаблению эффектов IL4 / IL13 был более эффективным в терапии астмы анти-IL4 / IL13 препаратами и в основном применялся в случаях легкой атопической астмы и в качестве дополнительного лечения на основе ингаляционных кортикостероидов и препаратов длительного действия. β2-агонист у пациентов с неконтролируемой персистирующей астмой [122,135].Недавно некоторые исследования показали, что дупилумаб, новый подход к лечению против IL4 / IL13, может уменьшить обострение астмы и улучшить функцию легких [122]. Однако эту терапию также необходимо было использовать в сочетании с ингибированием воспаления эозинофилов [99]. В результате отсутствия повторных исследований в нескольких популяциях безопасность и эффективность дупилумаба не могла быть полностью оценена [122]. Следовательно, необходимы клинические эксперименты и оценка безопасности дупилумаба.При обострении астмы были задействованы Т-клетки Th2, которые секретировали TNF-α и интерферон [8]. Уровни белка TNF-α и матричной РНК (мРНК) у пациентов с тяжелой астмой были повышены, а TNF-α способствовал воспалению дыхательных путей и гиперчувствительности дыхательных путей (AHR), которые играют центральную роль в ремоделировании дыхательных путей. TNF-α был химическим индуктором нейтрофилов и эозинофилов. Он участвует в активации Т-клеток и способствует переносу воспалительных клеток в легкие. При тяжелой астме TNF-α также рекрутирует нейтрофилы, индуцирует устойчивость к глюкокортикоидам и стимулирует рост фибробластов [136].TNF-α был важным плейотропным цитокином у пациентов с астмой и играл ключевую роль в гиперчувствительности дыхательных путей и других особенностях астмы. Препараты против TNF-α могут улучшить функцию легких, гиперреактивность дыхательных путей и снизить частоту обострений у пациентов с тяжелой астмой [137]. Соответствующие исследования и исследователи показали, что препараты против TNF-α полезны для подгруппы пациентов с высоким уровнем TNF-α в дыхательных путях с тяжелой астмой [137]. Было проведено несколько клинических испытаний биологических ингибиторов TNF-α, например инфликсимаба, этанерцепта и адалимумаба, которые имеют разный механизм действия.Инфликсимаб — это моноклональное антитело, которое предотвращает взаимодействие TNF-α с его рецепторами. Этанерцепт специфически связывается с фактором некроза опухоли (TNF) и модулирует связанные биологические процессы, регулируемые TNF. Адалимумаб также может специфически связываться с TNF-α и уменьшать вызванное TNF воспаление и останавливать разрушение тканей [118]. Исследование продемонстрировало, что этанерцепт может улучшить симптомы астмы у пациентов с тяжелой кортикостероидной астмой [123], и исследование также показало, что лечение этанерцептом привело к улучшению показателей качества жизни, связанных с астмой, у пациентов с легкой степенью тяжести. пациенты с астмой средней и средней степени тяжести [124].Однако в другом исследовании этанерцепт не показал очевидных терапевтических эффектов [138]. Лечение инфликсимабом могло снизить уровень TNF-α и улучшить функцию легких у пациентов с умеренной астмой и хорошо переносилось [125, 126]. Экспериментальное исследование показало, что адалимумаб может уменьшить повреждение легких на мышиной модели с острой астмой. Согласно приведенным выше клиническим испытаниям, общая эффективность этих препаратов при лечении астмы была умеренной, а безопасность препаратов против TNF-α была неопределенной [126].Препараты против TNF-α все еще вызывали споры для лечения астмы, лечение астмы следовало применять более осторожно, и эту терапию следовало использовать для определенных групп населения. Следовательно, для проверки эффективности и побочных эффектов ингибиторов TNF-α потребуются дополнительные большие образцы, эксперименты с множеством популяций и долгосрочные последующие эксперименты. Кроме того, применение препаратов против TNF-α, которые были нацелены на дифференциальный фенотип астмы, и правильный рецепт лечения имели важное значение в терапии астмы.Гистамин сыграл важную роль в процессе воспаления астмы, что привело к увеличению проницаемости сосудов, секреции слизи и сокращению гладкомышечных клеток дыхательных путей. Уровни мРНК HRh2 были значительно повышены у пациентов с астмой, а эффекты дозы были связаны с тяжестью астмы [53]. Более того, общие вариации гистаминового пути были связаны с аллергической астмой [107]. При сезонном аллергическом рините, ассоциированном с астмой, дезлоратадин может облегчить симптомы сезонного аллергического ринита и снизить суточную дозу β2-агонистов [128].Цистеин-лейкотриен также был важным медиатором астмы, который зависел от высвобождения арахидоновой кислоты и активации 5-липоксигеназы (ALOX-5). Кроме того, препараты, модифицирующие лейкотриены, использовались в качестве дополнительной терапии при тяжелой астме и в качестве основной терапии астмы у детей [14,65]. Антагонисты цистеинилового лейкотриенового рецептора 1 (CYSLTR1) и ингибитор ALOX-5 были основными препаратами, которые использовались для блокирования действия цистеинилового лейкотриена при астме [14]. Следовательно, CYSLTR1 и ALOX-5 были значимой мишенью для репозиции лекарств.Короче говоря, на основе генов, чувствительных к астме, некоторые лекарства потенциально могут быть использованы для лечения астмы (таблица 3). Многие из предсказанных лекарств были подтверждены экспериментальной оценкой в ​​части популяций, что подтвердило потенциальную эффективность генетического метода репозиционирования лекарств. Однако эти препараты не были воспроизведены в более крупных группах, и мы не нашли никаких сообщений об этих репозиционированных препаратах, таких как лонапален, флобуфен, мазопрокол, LY-2300559 и иксекизумаб, для лечения астмы.

Золотые минерализации в юго-западном Иберийском пиритовом поясе

  • Бернар, А.Дж., Солер, А .: Aperçu sur la Province, pyriteuse Sud-Iberique. В: Bartolomé, P. (ed): Gisements stratiformes et provinces cuprifères. Liege soc. Геол. Белг., Стр. 287–315 (1974)

  • Boogard, M. van den: Геология региона Помарао (Южная Португалия). Диссертация, Univ. Амстердам (1967)

  • Boogard, M. van den, Schermerhorn, L.J.G .: Фауна конодонтов из Португалии и Юго-Западной Испании.Скрипт Геол. Лейден: 28: 1–43 (1975)

    Google Scholar

  • Бойл Р.У .: Геохимия золота и его месторождений. Может. Геол. Обзорный бык. 280, Оттава, стр. 197–207 (1979)

  • Лады, округ Колумбия, Балде, Р .: Медно-золотое месторождение горы Морган. В Knight, C.L. (Ред.). Экон. Геол. Австралии и Папуа-Новой Гвинеи, I. Metals. Austr. Inst. Металл. Пн. 5, стр. 779–785 (1975)

  • Гарсия Паломеро, Ф.: Caracteres geológicos y relaciones morfológicas y genéticas de los yacimientos del Anticlinal de Rio Tinto, Диссертация, Univ. Саламанка, стр. 1–263 (1980)

  • Хэннингтон, доктор медицины, Питер, Дж. М., Скотт, С.Д .: Золото в месторождениях полиметаллических сульфидов морского дна. Экон. Геол. 81: 1867–1883 ​​(1986)

    Google Scholar

  • Хьюстон, Д.Л., Лардж, Р.Р .: Распределение, минералогия и геохимия золота и серебра в северном рудном теле, Роузбери, Тасмания.Экон. Геол. 83: 1181–1192 (1988)

    Google Scholar

  • Хьюстон Д.Л., Лардж Р.Р .: Химическая модель концентрации золота в вулканогенных месторождениях массивных сульфидов. Обзор рудной геологии, 4, с. 171–200 (1989)

    Google Scholar

  • Instituto Geologico Y Minero De España: Síntesis geológica de la Faja Pirítica del SO de España. Servicio de Publicaciones, Ministerio de Industria y Energía, tomo 98, Madrid, p.1–106

  • Knuckey, M.J., Comba, C.D.A., Rivering, G .: Структура, металлическое зонирование и изменения на месторождении Милленбах, Норанда, Квебек. В Hutchinson et al .: Докембрийские сульфидные месторождения, Геол. Доц. Может. Специальная бумага, 25, с. 255–295 (1982)

  • Накки, М.Дж., Уоткинс, Д.Дж .: Геология месторождения массивных сульфидов Корбет, Норанда, Квебек, Канада. В Hutchinson et al .: Докембрийские сульфидные месторождения, Geol. Доц. Может. Спец. Бумага, 25, с.296–317 (1982)

  • Large, R.Р .: Химическая эволюция и зональность массивных сульфидных месторождений вулканических террейнов. Экон. Геол. 72: 549–552 (1977)

    Google Scholar

  • Large, R.R., Both, R.A .: вулканогенные сульфидные руды на горе Чалмерс, Восточный Квинсленд. Экон. Геол. 75: 992–1009 (1980)

    Google Scholar

  • Large, R.R., McGoldrick, P.G., Berry, R.F., Young, C.H .: плотно сложенное, богатое золотом, массивное сульфидное месторождение: Que River Mine, Тасмания.Экон. Геол. 83: 681–693 (1988)

    Google Scholar

  • Мацукума, Т .: Геология штокверковых отложений типа Куроко на руднике Цучихата, префектура Иватэ. Мин. Геол. Спец. Выпуск № 6, с. 169–181 (1974)

  • Маккей, У.Дж., Хазелден, Р.К .: Сульфидное месторождение Zn-Pb-Cu Вудлона, Северо-Западный Южный Уэльс, Австралия: интерпретация рудообразования на основе полевых наблюдений и зонирования металлов. Экон. Геол. 82: 141–164 (1987)

    Google Scholar

  • МакАртур, Г.Дж .: Массивное сульфидное месторождение Хеллайер (аннотация) в Large, R.R. (Ed.). Mt. Прочтите «Вулканические породы и связанные с ними рудные месторождения». Геол. Soc. Aus., Tasmanian Div., Стр. 11–20 (1986)

  • Омото, Х., Мисуками, М., Драммонд, С.Э., Элдридж, К.С., Писута-Арнонд, В., Лено, Т.К .: Химические процессы образования Куроко. В Ohmoto, H. и Skinner, B.J. (ред.). Куроко и связанные с ним вулканогенные массивные сульфидные месторождения. Экон. Геол. Пн. 5, стр. 570–604 (1983)

  • Сато, Дж.: Руды и рудные минералы из шахты Шаканай, префектура Акита, Япония. В Исихара, Д. (Ред.). Геология месторождений Куроко. Мин. Геол. Спец. Выпуск № 6, с. 323–336 (1974)

  • Шермерхорн, L.J.G .: Общая стратиграфия Иберийского пиритового пояса. Бол. Геол. у Минеро, 82: 239–268 (1971)

    Google Scholar

  • Shimazaki, Y: Рудные полезные ископаемые месторождений типа Куроко. Мин. Геол. Спец. Выпуск № 6, с. 311–322 (1974)

  • Штраус, Г.К .: Zur Geologie der SW-Iberischen Kiesprovinz und ihrer Lagerstätten, mit besonderer Berücksichtigung der Pyritgrube Lousal / Portugal. Дисс. Univ. München, p. 1–152 (1965)

  • Штраус, Г.К., Мадел, Дж .: Геология массивных сульфидных месторождений в испанско-португальском пиритовом поясе. Геол. Рдщ., 63 (1): 191–211 (1974)

    Google Scholar

  • Штраус, Г.К., Мадел, Дж., Фернандес Алонсо, Ф .: Практика разведки связанных пластами вулканогенных сульфидных месторождений в португальско-испанском пиритовом поясе.В: Klemm, D.D., Schneider, H.J. (Eds.) — Временные и пластовые рудные месторождения, стр. 55–93, Берлин-Гейдельберг-Нью-Йорк: Springer 1977

    Google Scholar

  • Штраус, Г.К., Грей, К.Г .: Сложные колчеданные руды Пиренейского полуострова и их обогащение, с особым упором на Tharsis Co. Mines, Испания. Inst. Мин. Металл., Лондон (1981)

    Google Scholar

  • Штраус, Г.К., Роджер, Г., Леколле, М., Лопера, Э .: Геохимическое и геологическое изучение вулканогенно-осадочного сульфидного рудного тела Ла-Сарса, провинция Уэльва, Испания. Экон. Геол. 76: 1975–2000 (1981)

    Google Scholar

  • Штраус Г.К., Грей К.Г .: Месторождения цветных металлов в Иберийском пиритовом поясе. В кн .: Геология и металлогения медных месторождений. п. 304–324, Берлин-Гейдельберг-Нью-Йорк: Springer 1986

    Google Scholar

  • Уильямс, Д., Стэнтон, Р.Л., Рамбо, Ф .: Планы — колчеданное месторождение Сан-Антонио в Рио-Тинто, Испания: его природа, окружающая среда и генезис. Пер. Inst. Мин. Металл. Лондон, Сект B 84: B73-B82 (1975)

    Google Scholar

  • Ямада, Р., Суяма, Т., Огуши, Н .: Золотосодержащие кремнистые руды месторождения Нурукава Куроко, префектура Акита, Япония. Горная геология, 37 (2): 109–118, Tokio (1987)

    Google Scholar

  • Ранний В-клеточный ответ человека на вирус Эбола в четырех единицах измерения.S. Выжившие после инфекции

    РЕФЕРАТ

    Ответ человеческих В-клеток на естественные филовирусные инфекции сразу после выздоровления плохо изучен. Предыдущие серологические исследования показывают, что у некоторых выживших после вируса Эбола проявляются отсроченные ответы антител с низкой степенью и качеством. Здесь мы стремились изучить популяцию индивидуальных В-клеток памяти, индуцированных в раннем периоде выздоровления. Мы выделили моноклональные антитела (MAb) из В-клеток памяти от четырех выживших, получавших лечение от болезни, вызванной вирусом Эбола (БВВЭ), через 1 или 3 месяца после выписки из больницы.В первые моменты времени после восстановления частота встречаемости В-клеток, специфичных для вируса Эбола, была низкой, и преобладали клоны, которые были перекрестно реактивными как с гликопротеином вируса Эбола (GP), так и с секретируемой формой GP (sGP). Из 25 мАт, выделенных от четырех доноров, только одно проявило нейтрализующую активность. Это нейтрализующее MAb, обозначенное MAb EBOV237, распознает эпитоп в гликановом кэпе поверхностного гликопротеина. In vivo исследования с летальным заражением на мышах показали, что EBOV237 обеспечивает защиту при профилактическом введении на уровне, аналогичном уровню компонента ZMapp MAb 13C6.Результаты показывают, что человеческий ответ В-клеток на БВВЭ через 1-3 месяца после выписки характеризуется нехваткой широких или мощных нейтрализующих клонов. Однако нейтрализующий эпитоп в гликановом кэпе, распознаваемый EBOV237, может играть роль в раннем человеческом ответе антител на БВВЭ, и его следует учитывать при разработке стратегий рационального проектирования новых вакцин-кандидатов против вируса Эбола.

    ВАЖНОСТЬ Патогенез болезни, вызванной вирусом Эбола (БВВЭ), у людей сложен, а механизмы, влияющие на иммунитет, плохо изучены.В частности, похоже, что качество и величина ответа В-клеток человека сразу после выздоровления от БВВЭ могут быть снижены по сравнению с большинством вирусных инфекций. Здесь мы выделили человеческие моноклональные антитела из В-клеток четырех выживших после БВВЭ через 1 или 3 месяца после выписки из больницы. В-клетки памяти, специфичные для вируса Эбола, в начале периода выздоровления встречались редко, а антитела, которые они кодировали, демонстрировали слабую нейтрализующую активность. Одно нейтрализующее антитело, защищающее мышей от летальной инфекции, EBOV237, было идентифицировано в панели из 25 выделенных человеческих антител.Распознавание эпитопа гликанового кэпа, распознаваемого EBOV237, предполагает, что этот антигенный сайт следует учитывать при разработке вакцины и стратегиях лечения БВВЭ.

    ВВЕДЕНИЕ

    Вирус Эбола является членом семейства Filoviridae и вызывает периодические вспышки тяжелой болезни, вызванной вирусом Эбола (БВВЭ) человека. В настоящее время в провинции Северное Киву Демократической Республики Конго (ДРК) имеется вспышка заболевания, о чем 1 августа 2018 года объявило Министерство здравоохранения ДРК.По состоянию на 15 августа 2018 г. подтвержден 51 случай заболевания Эболой, включая 17 смертельных случаев (https://wwwnc.cdc.gov/travel/notices/watch/ebola-democratic-republic-of-the-congo). В 2014 году крупная вспышка произошла в Западной Африке, в результате чего в Гвинее, Либерии и Сьерра-Леоне было зарегистрировано в общей сложности 28 616 случаев БВВЭ и 11310 смертей, а также 36 случаев и 15 смертей, произошедших в результате распространения вспышки за пределы этих три страны (https://www.cdc.gov/vhf/ebola/history/2014-2016-outbreak/index.html). В настоящее время разрабатываются экспериментальные вакцины, антитела, малые молекулы и РНК для лечения инфекции, вызванной вирусом Эбола, которые предназначены для предотвращения или лечения инфекции с использованием иммунологических принципов. Действительно, мы и другие показали, что в поздние моменты времени после выздоровления выжившие обладают В-клетками памяти в циркуляции, определяющими широкие и мощные защитные антитела (1–6). Моноклональные антитела (MAb), выделенные из человеческих B-клеток выживших, могут оказывать сильные терапевтические эффекты на экспериментальных моделях инфекции у нечеловеческих приматов с использованием коктейлей из MAb или даже монотерапии (7–9).

    Вирус Эбола представляет собой оболочечный несегментированный вирус РНК с отрицательной цепью (http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/ebola-virus-disease). Вместе с марбургскими вирусами и куевавирусами эти члены составляют семейство Filoviridae . Существует шесть видов вируса Эбола: эболавирус Заира (EBOV), эболавирус Bundibugyo (BDBV), суданский эболавирус (SUDV), эболавирус Тайского леса (TAFV), эболавирус Рестона (RESV) и эболавирус Бомбали (BOMV). Из этих видов EBOV, BDBV и SUDV являются основными видами, ассоциированными со смертельным исходом у людей (1).Поверхностный гликопротеин (ГП) вируса Эбола является основной мишенью нейтрализующих антител. Ген гликопротеина оболочки вируса Эбола кодирует два GP посредством редактирования транскрипции. Основным продуктом гена является растворимая димерная форма GP (sGP), содержащая 364 остатка. Точная роль sGP в инфицировании вирусом Эбола не ясна. Однако считается, что sGP может служить приманкой для отвлечения иммунного ответа на уклонение от вируса или способствовать патогенезу (10). Минорный продукт гена представляет собой вирусный поверхностный GP из 676 остатков, который прикреплен к вирусной оболочке.GP состоит из двух субъединиц, GP1 и GP2, которые образуют тримерную структуру на поверхности вируса. Субъединица GP1 содержит сильно гликозилированный муцин-подобный домен и гликановый кэп, которые протеолитически расщепляются катепсинами внутри эндосомы во время проникновения вируса в клетку-хозяин (10, 11). Это обнажает рецептор-связывающий сайт на субъединице GP1, которая взаимодействует с эндосомальным рецептором, доменом C белка С1 Ниманна-Пика (NPC1) (12). При связывании с рецептором слитная петля субъединицы GP2 становится открытой, что делает возможным слияние вируса с эндосомальной мембраной (10, 11).Участие GP в прикреплении вируса и проникновении в клетки-хозяева, связывании рецептора внутри эндосомы и слиянии мембраны с эндосомальной мембраной приводит к тому, что GP становится основной мишенью для нейтрализации MAb (5).

    Коктейли из химерных мышей и людей (ZMapp, ZMab и MB-003) и человеческих MAb, вводимых в качестве монотерапии, продемонстрировали мощную нейтрализующую и ненейтрализующую активность для профилактики и лечения вируса Эбола (EBOV) на экспериментальных моделях животных с инфекцией, включая ZMapp защита нечеловеческих приматов (7–9).MAb, охарактеризованные нацелены на различные антигенные сайты на GP, включая гликановый колпачок, сайт связывания рецептора GP1, головку GP1, интерфейс GP1 / GP2, петлю слияния GP2, стебель GP2 и область HR2 / MPER (1-6, 12-18) . Некоторые МА, которые распознают антигенные сайты, присутствующие на гликановой крышке и головке GP1, перекрестно реагируют с sGP (1, 5, 10, 13, 18). Коктейль ZMapp (2G4, 4G7 и 13C6) состоит из трех химерных MAb мыши и человека, которые распознают EBOV GP. 2G4 и 4G7 распознают основание GP на интерфейсе GP1 / GP2 и проявляют мощную нейтрализующую активность in vitro (16-18).Другой компонент ZMapp — это слабо нейтрализующее MAb, 13C6, которое распознает гликановый кэп и перекрестно реагирует с EBOV sGP.

    Характеристика MAb, выделенных в поздние моменты времени после восстановления, была описана ранее; однако ранний ответ человеческих В-клеток на EBOV все еще плохо изучен, особенно на клональном уровне. Чтобы изучить ранний ответ на инфекцию EBOV, мы воспользовались беспрецедентной возможностью изучить острую реакцию на инфекцию четырех U.Медицинские работники S.heath, инфицированные в Западной Африке, проходили курс интенсивной терапии и наблюдение в больнице Университета Эмори. Острый ответ на инфекцию характеризовался необычно долгим периодом иммунной активации, о чем свидетельствует сохранение активированных CD8 и CD4 Т-клеток и плазмобластов даже через 1 месяц после выписки пациентов из больницы, а также другие стойкие признаки иммунной активации (19 ). Исследования также выявили очень длительное сохранение инфекционного вируса в иммунных зонах, включая глаза (20, 21) и семенную жидкость (22), которое может длиться более 2 лет.На доклинических моделях было показано, что как поликлональные, так и моноклональные антитела обладают мощным противовирусным действием против филовирусной инфекции и заболевания. Действительно, мы и другие показали, что в поздние моменты времени после выздоровления выжившие обладают В-клетками памяти в циркуляции, определяющими широкие и мощные защитные антитела (1–6). Однако ранний ответ человеческих В-клеток на EBOV плохо определен. Здесь мы исследовали ответ В-клеток у выживших через 1 и 3 месяца после выписки, в то время, когда сохранялась иммунная активация и вирус мог сохраняться в иммунных привилегированных участках.Результаты показывают, что вскоре после разрешения виремии реакция B-клеток памяти в крови характеризуется низкой частотой EBOV-специфических B-клеток, при этом антитела, кодируемые этими клетками, проявляют низкую нейтрализующую активность.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Выделение GP-реактивных MAb человека от выживших после лихорадки Эбола Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были изолированы от пациентов, переживших БВВЭ (обозначенные субъекты EVD2, EVD5, EVD9 и EVD15) через 1 или 3 месяца после их выписки из больницы. Университетская больница Эмори.PBMC трансформировали EBV, и после размножения клеточные супернатанты подвергали скринингу для определения относительной величины ответов B-клеток на растворимые формы вируса Эбола (EBOV), вируса Bundibugyo (BDBV), суданского вируса (SUDV) и вируса Марбург ( MARV) гликопротеиновые (GP) эктодомены. Из соответствующих данных иммуноферментного анализа (ELISA) были построены графики Circos, чтобы проиллюстрировать перекрестную реактивность B-клеточных ответов каждого донора на различные гликопротеины (рис. 1A и B).Относительная высота каждой полоски на фиг. 1 указывает значения оптической плотности (OD) при 405 нм, определенные с помощью ELISA. Субъекты EVD2 и EVD5 имели более выраженный и широкий B-клеточный ответ на этих терапевтов через 1 месяц после выписки из больницы, чем субъекты EVD9 и EVD15. Однако у субъекта EVD15 через 3 месяца после выписки из больницы наблюдалось усиление реакции В-клеток на этих терапевтов по сравнению с 1 месяцем. Реакционная способность EBOV GP и секретируемых GP (sGP) -специфичных линий В-клеток была в первую очередь перекрестной реактивностью EBOV GP / sGP (рис.1C) для всех субъектов в оба момента времени, за исключением EVD15 в момент времени 1 месяц (EVD15_1). Кроме того, большая часть реактивности В-клеток была по отношению к EBOV GP и sGP. Наблюдалось увеличение перекрестной реактивности к BDBV GP образцов субъектов через 3 месяца по сравнению с 1 месяцем после выписки, что указывает на то, что развитие этих антител происходило в течение периода выздоровления. Незначительный процент реактивных В-клеток был перекрестно реактивным с EBOV, BDBV и SUDV GP и снова увеличивался через 3 месяца по сравнению с 1 месяцем после выписки.

    ФИГ. 1. Циркулярным кружком

    изображены перекрестно-реактивные В-клеточные ответы четырех выживших после БВЭ. (A и B) Образцы PBMC, выделенные от субъектов EVD2, EVD5, EVD9 и EVD15 через 1 месяц (A) или 3 месяца (B) после выписки, были трансформированы EBV и впоследствии увеличены. Супернатанты трансформированных линий В-клеток сначала проверяли на связывание с растворимой формой полноразмерного внеклеточного домена MARV, SUDV, EBOV или BDBV GP. Высота линий указывает относительную интенсивность значений оптической плотности (OD) при 405 нм, как определено с помощью ELISA с использованием указанного GP.Черные линии указывают на антитело, связанное только с GP одного вида. Оранжевые, синие и красные линии представляют собой перекрестно-реактивные ответы В-клеток на ГП от двух, трех и четырех видов вирусов соответственно. Для образцов PBMC, выделенных от доноров EVD9 и EVD15 через 3 месяца после выписки, реактивность супернатанта трансформированных B-клеточных линий не тестировалась против MARV GP. (C) Реактивность линий B-клеток EBOV, BDBV, SUDV GP и EBOV представлена ​​как процент от общего количества GP и / или sGP-специфичных B-клеточных линий.Положительная реакционная способность была определена по значениям оптической плотности> 0,8 при 405 нм. Значения нанесены на карту в соответствии с процентной реактивностью:> 60% — темно-зеленый, от 30% до 60% — светло-зеленый и <30% - светло-зеленый.

    Мы выделили человеческие MAb, специфичные к EBOV, BDBV и SUDV GP или EBOV sGP, из трансформированных В-клеток. Была выделена панель из 25 человеческих MAb. Полумаксимальная эффективная концентрация (EC 50 ) значений связывания для GP-реактивных человеческих MAb EBOV, определенная с помощью ELISA, указана на фиг.2А. MAb демонстрировали значения для EC 50 в различных диапазонах, включая от 0 до 100 нг / мл, от 100 до 1000 нг / мл, от 1000 до 10000 нг / мл или более 10000 нг / мл, как показано на тепловой карте темно-красный, оранжевый или желтый цвет или знак «больше» (>) соответственно. EBOV GP-реактивные человеческие MAb разделены на четыре группы, причем две подгруппы (A и B) для групп 1 и 2 обозначены на основе характера реактивности по отношению к различным GP. Подгруппа A указывает MAb, которые связывают GP и EBOV sGP, предполагая, что гликановый кэп GP1 является сайтом связывания GP для этих MAb, тогда как MAb из подгруппы B связывают только GP.Повышение перекрестной реактивности, EBOV, BDBV и SUDV в группе 1, EBOV и BDBV или SUDV в группе 2. Группировать sGP MAb, привязанные только к sGP EBOV. Ни одно из этих MAb не связано с MARV GP. Выделение MAb, в первую очередь от субъектов EVD2 и EVD5 через 1 и 3 месяца после выписки, отражает интенсивность и широкий ответ B-клеток, измеренный первоначально с супернатантами линии B-клеток, трансформированных EBV, как показано на графиках Circos (рис. 1A и B). .

    Рис. 2.

    Характеристики связывания и нейтрализации MAb EBOV237.(A) Двадцать пять человеческих моноклональных антител (MAb) были выделены из четырех выживших с БВВЭ, с указанием соответствующего количества субъектов и месяца выделения PBMC после выписки. Эти MAb организованы в группы и подгруппы в зависимости от широты их связывания для различных врачей общей практики. Из 25 MAb все, кроме двух, связаны с EBOV GP. Эти MAb связываются только с полноразмерным sGP EBOV и называются sGP. Подгруппа A включает MAb, которые способны связываться с полноразмерными EBOV GP и EBOV sGP. Подгруппа B включает MAb, которые связаны только с полноразмерным EBOV GP.Группы 1, 2 и 3 указывают ширину от MAb до EBOV, EBOV и BDBV и EBOV, BDBV и SUDV GP соответственно. Значения EC 50 : <100 нг / мл - красным, <1000 нг / мл - оранжевым и <10 000 нг / мл - желтым. EC 50 значения> 10 000 нг / мл отмечены белым цветом и обозначены символом>. Показанные значения EC 50 представляют собой среднее трех технических повторений и репрезентативны для двух повторяющихся ELISA с аналогичными результатами. Данные нейтрализации для каждого MAb показаны либо как положительные, либо как отрицательные, при этом EBOV237 показан красным.(B) Кривая связывания EBOV237 с полноразмерным EBOV, BDBV, SUDV, MARV GP или EBOV sGP, измеренная по OD при 405 нм при увеличении концентрации MAb. (C) Данные нейтрализации EBOV237, определенные с помощью тестов нейтрализации уменьшения зубного налета при 50% (PRNT 50 ) или 80% (PRNT 80 ) снижении, что соответствует указанным значениям IC 50 0,75 мкг / мл и 1,56 мкг / мл соответственно. НД, не проверял.

    EBOV237, нейтрализующее MAb.Для определения противовирусной активности реактивных человеческих MAb EBOV GP проводили анализы нейтрализации против вируса Эбола Заир (EBOV / Kik-9510621, CDC No.807224). Тесты нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT) проводили для определения титра конечной точки для 50% (PRNT 50 ) или 80% (PRNT 80 ) уменьшения бляшек по сравнению с контролем, содержащим только вирус. Из панели из 25 человеческих MAb EBOV одно MAb (обозначенное EBOV237) нейтрализовало PRNT 50 0,78 мкг / мл и PRNT 80 1,56 мкг / мл (фиг. 2C).

    Репрезентативная кривая связывания EBOV237 с полноразмерным EBOV, BDBV, SUDV или MARV GP или EBOV sGP показана на рис.2Б. EBOV237 связывался с EBOV GP, BDBV GP и EBOV sGP со значениями EC 50 25, 3367 и 9 нг / мл соответственно. EBOV237 не связывал SUDV и MARV GP. Таким образом, EBOV237 в первую очередь связывается с EBOV GP, EBOV sGP и BDBV GP, хотя и с более низким сродством. Более сильное связывание EBOV237 с EBOV GP по сравнению с другими человеческими MAb EBOV коррелировало с его нейтрализующей активностью по отношению к EBOV.

    Картирование эпитопа EBOV237 в области гликанового кэпа EBOV GP1. Для определения эпитопов, распознаваемых панелью человеческих MAb EBOV, были выполнены анализы конкурентного связывания с MAb, которые связывались с EBOV GP или sGP, как определено по a> 0.Сдвиг на 19 нм интерференционной картины света посредством биослойной интерферометрии. Четыре группы эпитопов были идентифицированы на EBOV GP из панели EBOV человеческих MAb. Рекомбинантные формы двух MAb, которые являются компонентами терапевтического коктейля ZMapp (2G4 и 13C6), использовали в качестве контролей для связывания с EBOV GP. Эпитопы для 2G4 и 13C6 известны, поскольку они связываются с основанием GP или с гликановым кэпом GP1 соответственно (17, 18). Ни одно из протестированных MAb не конкурировало с 2G4, что указывает на то, что эти MAb не связываются с основанием EBOV GP.EBOV237 не конкурировал за связывание ни с 2G4, ни с 13C6 (фиг. 3A), что указывает на то, что EBOV237 связывается с отдельным сайтом на EBOV GP. EBOV237 конкурировал за связывание с EBOV173 и EBOV236, что позволяет предположить, что эти человеческие MAb EBOV связываются с аналогичными сайтами на EBOV GP. Также было идентифицировано несколько однонаправленных пар, таких как EBOV173 и 13C6. Это может быть связано с различием угла связывания первого MAb относительно второго MAb. Это могло бы позволить связывание MAb в одном направлении, но не в другом.Кроме того, относительная кинетика связывания первого MAb может также учитывать однонаправленную конкуренцию связывания MAb. EBOV237 и ранее выделенное нейтрализующее MAb BDBV, BDBV43 (1), конкурировали с человеческими MAb EBOV на EBOV sGP (фиг. 3B). Помимо конкуренции с BDBV43, EBOV237 частично конкурировал с EBOV29 или EBOV102 на EBOV sGP. EBOV237 не конкурировал за связывание с ранее выделенным ненейтрализующим MAb BDBV91, которое, как известно, связывается с гидрофобным карманом на границе димера EBOV sGP (10).

    Фиг. 3.

    Картирование эпитопа EBOV237 указывает на связывание с гликановым кэпом. (A и B) Показан анализ конкурентного связывания MAb с полноразмерным EBOV GP (A) и EBOV sGP (B). Цифры указывают остаточный процент связывания второго антитела в присутствии первого антитела по сравнению с отсутствием первого антитела. Снижение процента связывания второго антитела до <30% из-за присутствия первого антитела (черные прямоугольники с белыми числами) указывает на полную конкуренцию за связывание.Снижение процента связывания второго антитела с 30% до 70% из-за присутствия первого антитела (серые прямоугольники с черными числами) указывает на промежуточную конкуренцию. Снижение процента связывания второго антитела до <30% из-за присутствия первого антитела (белые прямоугольники с красными числами) указывает на отсутствие конкуренции. (C - E) Эпитоп EBOV237 картировали путем скрининга библиотеки мутаций муцинового сканирования EBOV Δmucin GP, ​​экспрессируемой в клетках HEK-293T, со связыванием EBOV237, анализируемым с помощью проточной цитометрии.Это идентифицировало мутанты N278A и P279A как критические клоны, которые показали специфически пониженное связывание для Fab EBOV237 (<20% и <30% связывания с WT EBOV GP, соответственно; красная полоса), но высокий уровень связывания с контрольными MAb EBOV296, EBOV442, или EBOV520 (серые / белые полосы) (C). Планки погрешностей представляют собой среднее значение и диапазон (половина максимальных минус минимальных значений) как минимум двух повторяющихся точек данных. (D и E) Показана мономерная (D; вид сбоку) или тримерная (E; вид сверху) форма EBOV Δmucin GP, ​​с GP1 желтым и GP2 красным (PDB 5JQ3) (31).Критические связывающие остатки EBOV237 (N278, P279 и I260) с EBOV Δmucin GP обозначены зелеными сферами на любой структуре. S322 не показан, поскольку этот остаток соответствует муциноподобному домену EBOV GP. (F) Были выделены четыре мутантных вируса, ускользающих от нейтрализации антител, каждый с мутациями I260R и S322G. PRNT проводили с использованием 10, 1, 0,1, 0,01 или 0,001 мкг EBOV237, инкубированного либо с вирусом дикого типа (WT), либо с ускользающим мутантом 4. Числа для анализов, выполненных в трех повторностях, указывают количество БОЕ на лунку.

    Для идентификации ключевых остатков, распознаваемых EBOV237, мутации были введены в GP посредством мутагенеза с дробовиком EBOV GPΔmucin (вирус Эбола H.sapiens-tc / COD / 1976 / Yambuku-Mayinga [23], Δ311–461). Идентификация остатков N278 и P279 как критических остатков для связывания подтвердила, что эпитоп EBOV237 находится в пределах области гликанового кэпа GP1 (фиг. 3C-E). Критические остатки для EBOV237 консервативны в BDBV, поддерживая профиль перекрестной реактивности EBOV237 с BDBV GP.Однако снижение связывания EBOV237 с BDBV GP (значение EC 50 , 3367 нг / мл) предполагает, что могут быть задействованы другие факторы. Это также согласуется с профилем перекрестной реактивности EBOV237 в SUDV (не распознаваемом EBOV237), остатки 278 и 279 представляют собой D278 и A279, соответственно. Область гликанового кэпа GP1 также связывается MAb 13C6 из коктейля ZMapp. Остатки от G264 до W275, идентифицированные для связывания этого MAb с EBOV GP, лежат на кончике гликанового колпачка (10, 18). Разница в остатках, связанных EBOV237 и 13C6, согласуется с различиями, наблюдаемыми в анализах конкурентного связывания, проведенных с EBOV GP (рис.3А). Таким образом, даже несмотря на то, что эти два MAb связываются с гликановым кэпом GP1, EBOV237 и 13C6 распознают отдельные остатки или эпитопы в этом домене.

    Чтобы идентифицировать ключевые остатки, на которые селективно давят для мутации в присутствии EBOV237, мы выделили мутантные вирусы EbolaΔVP30-GFP, ускользающие от нейтрализации. Анализ последовательности EBOV GP для мутантных вирусов выявил мутантные остатки I260R и S322G. Эти две мутации были идентифицированы в четырех различных независимо отобранных мутантных вирусах, ускользающих от нейтрализации (рис.3F). PRNT подтвердили отмену нейтрализации ускользающего мутанта 4 в присутствии различных концентраций EBOV237 (фиг. 3F). Титры бляшек для ускользнувшего мутанта 4 были аналогичны титрам контрольного MAb VP35 для вирусов дикого типа или мутантных вирусов. Таким образом, EBOV237 избирательно заставляет вирус мутировать по этим ключевым остаткам, поскольку он связывает гликановый кэп GP1, что приводит к ускользанию вируса от нейтрализационных возможностей EBOV237. Мутация ускользания в I260 согласуется с местоположением гликанового кэпа и эпитопом EBOV237 (критические остатки N278 и P279).Однако мутация ускользания S322G предположительно оказывает аллостерический эффект, так как она расположена не внутри гликанового кэпа, а внутри муциноподобного домена. Перекрестная реактивность EBOV237 с sGP, в котором отсутствует остаток S322, также несовместима с включением S322 как части эпитопа.

    Исследования in vivo выявили коррелят защиты. Исследования с заражением мышами проводились для определения профилактической эффективности EBOV237. Первоначально группы из 10 самок мышей BALB / c в возрасте от 6 до 8 недель получали внутрибрюшинное лечение (т.е.p.) за 24 часа до инокуляции вируса (день -1) однократной дозой 100 мкг EBOV237. В группе положительного контроля мышей лечили внутрибрюшинно. со 100 мкг MAb 13C6. В группе отрицательного контроля мышей лечили внутрибрюшинно. с нерелевантным антителом IgG. В день 0 (d0) мышей инокулировали i.p. с 100 БОЕ адаптированного к мышам вируса Эбола Заир (Mayinga) (ma-ZEBOV). За мышами наблюдали ежедневно в течение 28 дней после заражения вирусом. EBOV237 обеспечивает такой же уровень защиты от инфекции ma-ZEBOV, что и MAb 13C6 положительного контроля (фиг.4А). Нерелевантное антитело IgG отрицательного контроля не защищало мышей от летальной инфекции. Для наблюдения за клиническими признаками заболевания за мышами наблюдали дважды в день в течение 28 дней после инокуляции вируса (фиг. 4B). Индивидуальные параметры оценки болезни включали нормальный (0), пониженный уход / взъерошенный мех (1), приглушенный, но нормальный при стимуляции (2), летаргическую, сутулую осанку, приглушенную даже при стимуляции (3) и выделения из носа / кровотечение / отсутствие реакции при стимуляции. / слабый / паралич (4). Животные, обработанные нерелевантным антителом IgG отрицательного контроля, проявляли несколько признаков заболевания.Животные, получавшие MAb 13C6 или EBOV237, также проявляли некоторые признаки заболевания. Однако в обеих этих группах наблюдалось уменьшение признаков клинического заболевания с небольшим улучшением для EBOV237. Групповой вес тела измеряли ежедневно в течение 28 дней после инокуляции вируса (фиг. 4C). Группы, обработанные EBOV237 или 13C6, показали небольшое изменение среднего веса мышей в течение 28 дней. Группа, обработанная нерелевантным антителом IgG отрицательного контроля, показала изменение среднего веса, соответствующее выживаемости мышей (рис.4А). Эти данные подтверждают профилактическую эффективность EBOV237 против инфекции ma-ZEBOV.

    Фиг. 4.

    EBOV237 обеспечивал профилактическую защиту от адаптированной к мышам инфекции вируса Эбола Заир (Mayinga). Мышам BALB / c в группах по 10 человек вводили 100 мкг EBOV237 внутрибрюшинно за 24 ч до заражения 100 БОЕ вируса Mayinga внутрибрюшинно. (A) Кривая выживаемости Каплана-Мейера показывает, что EBOV237 обеспечивает защиту от летального исхода, аналогичную MAb 13C6, по сравнению с нерелевантным IgG отрицательного контроля.(B) Показатели заболевания регистрировались на основе самого больного животного в каждой экспериментальной группе в течение 28 дней (нормальный [0], пониженный уход / взъерошенный мех [1], приглушенный, но нормальный при стимуляции [2], вялость, сутулость). , подавленный даже при стимуляции [3], выделения из носа / кровотечение / отсутствие реакции при стимуляции / слабость / паралич [4]). Животные, получавшие MAb 13C6 или нерелевантный отрицательный контрольный IgG, проявляли несколько признаков заболевания, с улучшением, показанным для EBOV237. (C) Средний вес мышей (рассчитанный из веса группы, деленного на количество взвешенных мышей), взятых в течение 28-дневного курса.У мышей, получавших EBOV237 или 13C6, средний вес мышей отличался незначительно в ходе исследования. У мышей, получавших нерелевантное антитело IgG отрицательного контроля, наблюдались вариации в среднем весе.

    Кривая доза-ответ также была построена для определения эффективности защиты EBOV237 от адаптированного к мышам вируса Эбола Заир (Mayinga) (ma-ZEBOV). За 24 ч до инокуляции вируса группам из 10 самок мышей BALB / c в возрасте от 6 до 8 недель вводили внутрибрюшинную терапию. с разовой дозой 200, 100, 50 или 25 мкг EBOV237.Группы положительного и отрицательного контроля были такими же, как описано для первоначального исследования. В день 0 мышей инокулировали внутрибрюшинно. с 100 БОЕ ма-ЗЕБОВ. За мышами наблюдали ежедневно в течение 21 дня после заражения вирусом. Выживаемость зависела от введенной дозы EBOV237, при этом доза 200 мкг обеспечивала защиту от инфекции ma-ZEBOV, аналогичную положительному контролю MAb 13C6, введенному в дозе 100 мкг (фиг. 5A). У животных, получавших EBOV237, наблюдалось дозозависимое уменьшение признаков заболевания.Аналогичное улучшение заболевания наблюдалось у мышей, получавших 200 мкг EBOV237 и положительный контроль MAb 13C6 (фиг. 5B). Небольшие вариации в среднем весе мышей в течение 21 дня наблюдались у животных, получавших любую дозу EBOV237, по сравнению с животными, получавшими нерелевантное антитело отрицательного контроля.

    FIG 5

    EBOV237 обеспечивает дозозависимую эффективность. Группам из 10 мышей внутрибрюшинно вводили 200, 100, 50 или 25 мкг EBOV237, 100 мкг MAb 13C6 положительного контроля или 100 мкг нерелевантного IgG отрицательного контроля за 24 ч до заражения 100 БОЕ вируса Mayinga. внутрибрюшинно.(A) Кривая выживаемости Каплана-Мейера в течение 21 дня демонстрирует степень выживаемости в зависимости от дозы MAb. EBOV237, введенный в дозе 200 мкг, обеспечивал такой же уровень защиты от смертельного заболевания, вызываемого вирусом Mayinga, как MAb 13C6, по сравнению с нерелевантным IgG отрицательного контроля. (B) Индивидуальные показатели заболевания определялись в течение 21 дня (нормальный [0], пониженный уход / взъерошенный мех [1], приглушенный, но нормальный при стимуляции [2], летаргическая, сгорбленная поза, приглушенная даже при стимуляции [3]) , выделения из носа / кровотечение / отсутствие реакции при стимуляции / слабость / паралич [4]).Снижение оценки заболевания наблюдалось дозозависимым образом для животных, получавших EBOV237. (C) Средний вес мышей (рассчитанный из веса группы, деленного на количество взвешенных мышей), взятых в течение курса продолжительностью 21 день. У мышей, получавших любую дозу EBOV237 или 13C6, средний вес мышей отличался незначительно в ходе исследования по сравнению с мышами, получавшими нерелевантный отрицательный контроль IgG.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    В этом исследовании мы обнаружили, что общий ответ человеческих В-клеток на инфекцию Заирского эболавируса (EBOV) на ранних стадиях выздоровления низок по частоте EBOV-специфических В-клеток, а кодируемые антитела обычно обладают ограниченной нейтрализующей способностью.Большая часть предыдущих работ по ответу В-клеток человека на инфекцию EBOV была сосредоточена на клетках, полученных спустя много времени после заражения. В более поздние моменты времени мы и другие наблюдали высокую частоту циркулирующих В-клеток, которые включают клоны, кодирующие широкие и мощные защитные антитела (1–6). Предыдущие серологические исследования предполагают, что некоторые люди, пережившие EBOV, не обладают ответами нейтрализующих антител с высоким титром до более позднего периода после выздоровления от инфекции. Было неясно, было ли это наблюдение связано только с отсроченным или низким уровнем секреции антител плазматическими клетками или же ответ был фундаментально недостаточным в отношении частоты вирусспецифических В-клеток, секретирующих высококачественные антитела.Используя клоны В-клеток, здесь мы показываем, что ранний ответ характеризуется как низкой величиной ответа В-клеток, так и низким функциональным качеством антител, определяемых этими В-клетками. Однако у этих субъектов наблюдались вариации в ответе антител, при этом EVD2 и EVD5 демонстрировали более высокий и широкий ответ на различные виды EBOV. Неясно, почему существуют различия в реактивности В-клеток у этих субъектов. Возможно, что различия в назначаемом лечении потенциально способствуют специфическому иммунному ответу для каждого субъекта, поскольку субъекты EVD2 и EVD5 получали ZMapp, тогда как EVD9 и EVD15 получали продукт малой интерферирующей РНК (siRNA) и ингибитор ДНК-полимеразы, соответственно. в дополнение к сыворотке фазы выздоровления (19).Кроме того, эти различия также могут быть объяснены тяжестью заболевания. Необходимы дальнейшие исследования для изучения влияния на индукцию В-клеток пациента после определенного режима лечения БВВЭ.

    Всего мы выделили 25 мкАТ от четырех доноров из США, переживших БВВЭ. Образцы крови собирали через 1–3 месяца после выписки для представления временных точек раннего выздоровления. Из этих MAb только одно, EBOV237, обладало детектируемой нейтрализующей активностью, и оно было выделено у субъекта EVD5 через 3 месяца после выписки.Интересно, что в раннем ответе В-клеток доминировали клоны, которые распознавали секретируемую форму гликопротеина EBOV (sGP). Это открытие может указывать на то, что начальный ответ В-клеток на инфекцию EBOV в основном управляется sGP, который может служить приманкой, позволяющей вирусу уклоняться от иммунного ответа. Низкая частота нейтрализующей активности из выделенной панели MAb предполагает, что ответ В-клеток имеет низкое качество и количество на ранних этапах инфекции, а также указывает на важность агрессивного лечения заболевания на ранних этапах инфицирования и во время раннего выздоровления.

    Идентификация нейтрализующего эпитопа, распознаваемого EBOV237 с помощью нескольких лабораторных методов, показала, что EBOV237 распознает уникальный сайт внутри гликанового кэпа GP1. В частности, остатки N278 и P279 и остатки I260 и S322 были идентифицированы посредством мутагенеза аланинового сканирования и нейтрализации ускользающих мутантных вирусов, соответственно. Этот эпитоп находится в месте около вершины гликанового колпачка, аналогично химеризованным мышиным антителам, включенным в коктейль ZMapp, MAb 13C6, и коктейль ZMab, 1h4, которые также распознают гликановый колпачок GP1.Однако MAb 1h4 и 13C6 слабо нейтрализуют, и различия в узнавании эпитопа EBOV237 позволяют предположить, что это новое MAb связывается с несколько иной антигенной детерминантой в гликановом кэпе GP1, что позволяет ему иметь более сильную нейтрализующую активность против EBOV. В дополнение к активности нейтрализации вируса in vitro EBOV237 также проявлял профилактическую активность, аналогичную по сравнению с коктейлем ZMapp MAb 13C6, дозозависимым образом в отношении инфекции и заболевания, вызванного адаптированным к мышам вирусом Эбола Заир (Mayinga) ( ма-ЗЕБОВ) штамм.

    Результаты, представленные здесь, предполагают, что ответ человеческих В-клеток на БВВЭ на ранних этапах выздоровления характеризуется нацеливанием на гликановый кэп EBOV GP или sGP при небольшом количестве широких или мощных нейтрализующих клонов В-клеток. Однако нейтрализующий эпитоп в гликановом кэпе, распознаваемый EBOV237, может играть роль в раннем человеческом ответе антител на БВВЭ, и его следует учитывать в стратегиях рационального конструирования новых кандидатов-вакцин против EBOV.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Объекты исследования.Субъекты, обозначенные как EVD2, EVD5, EVD9 и EVD15, были пациентами, которые пережили EVD и проходили лечение в больнице Университета Эмори в 2014 году. Клиническое течение и профили иммунной активации для этих пациентов были описаны ранее (19, 24). Периферическая кровь у субъектов была собрана через 1 и 3 месяца после выписки из больницы. Образец, который дал MAb EBOV237, обозначен как EVD5_3, что указывает на идентификацию образца субъекта (EVD5) и момент времени забора периферической крови (3 месяца после выписки).Для обнаружения присутствия вируса были проведены множественные тесты ПЦР, которые были отрицательными, что указывало на отсутствие вируса в эти моменты времени. Институциональные наблюдательные советы (IRB) в Университете Эмори и Медицинском центре Университета Вандербильта одобрили протокол для набора и сбора образцов крови, используемых в этом исследовании. В частности, субъекты были зарегистрированы в соответствии с протоколом Эмори, IRB00076700, «Продольная характеристика иммунного ответа на инфекции, вызванные вирусом Эбола». Образцы были получены после того, как испытуемые дали письменное информированное согласие.РВМС были выделены и криоконсервированы в жидком азоте до использования.

    Получение гибридом человека. Ранее криоконсервированные РВМС быстро размораживали на водяной бане при 37 ° C. Клетки промывали и ресуспендировали в предварительно нагретой среде А (номер по каталогу 03801; ClonaCell-HY) перед трансформацией вируса Эпштейна-Барра (EBV). В 16 мл среды для роста B-клеток (среда A, 50 мкл CpG [2,5 мг / мл; олигонуклеотид Invitrogen ZOEZOEZZZZZOEEZOEZZZT], 15 мкл ингибитора Chk2 [10 мМ в диметилсульфоксиде {DMSO}; номер по каталогу.C3742; Sigma] и 20 мкл циклоспорина [1 мг / мл в этаноле; каталог нет. C1832; Sigma]) добавляли 4,5 мл фильтрата, содержащего EBV, из линии клеток B95.8 (ATCC CRL-1612). Затем добавляли PBMC и высевали по 50 мкл / лунку для 8-10 миллионов клеток на 384-луночный планшет (номер по каталогу 164688; Thermo Scientific). Через 7-10 дней при 37 ° C клетки размножали в четырех 96-луночных планшетах (номер по каталогу 353072; Falcon) по 200 мкл / лунку в 20 мл среды для размножения B-клеток (среда A, 50 мкл CpG, 15 мкл. Ингибитор Chk2 и облучение [9000 рад] гетерологичных PBMC человека [Nashville Red Cross] в концентрации 10 миллионов клеток / мл) на 96-луночный планшет.Планшеты инкубировали в течение дополнительных 4 дней при 37 ° C перед скринингом с помощью ELISA с очищенными гликопротеинами (описанными ниже и ранее описанными [1]). Клетки из положительных лунок, содержащие супернатант, реагирующий на EBOV-специфический ELISA, добавляли к 1 мл предварительно нагретой среды для цитофузии BTX (300 мМ сорбитола [каталожный номер 36021; Sigma], 0,1 мМ ацетата кальция [каталожный номер AC21105-2500; Fisher]. , 0,5 мМ ацетата магния [каталожный номер AC42387-0050; Fisher] и 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина [BSA; каталожный номер.A9418; Sigma]) в микроцентрифужных пробирках. Микроцентрифужные пробирки центрифугировали при 3000 об / мин в течение 4 мин и супернатант сливали. Эту процедуру повторяли всего три раза. Клетки HMMA 2.5 промывали 3 раза в среде для цитофузии BTX и ресуспендировали в среде для цитофузии BTX, всего 10 миллионов клеток / мл. Затем несекретирующие миеломные клетки HMMA 2.5 добавляли в микроцентрифужные пробирки, содержащие осадок B-клеток, трансформированных положительным EBV, всего 1,15 миллиона клеток на одно слияние.Эти клетки ресуспендировали и переносили в кювету для цитофузии (каталожный № 450125; BTX). Электрослияние клеток выполняли, как описано ранее (25). Кюветы инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин. Затем клетки добавляли к 21 мл среды HAT (400 мл среды A, 100 мл среды E [каталожный номер 03805; ClonaCell-HY], 50 × добавка среды HAT [100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина, 16 мкМ тимидин; каталожный номер H0262; Sigma], 150 мкл октагидрата уабаина [1 мг / мл; каталожный номер O3125; Sigma]) и высевали по 50 мкл / лунку в 384-луночные планшеты.Планшеты инкубировали в течение 18 дней при 37 ° C в 7% CO 2 перед скринингом с помощью ELISA.

    Производство и очистка человеческих MAb. Положительные лунки от гибридомных слитков, содержащие супернатант, реактивный для EBOV-специфического ELISA, клонировали биологически путем сортировки клеток, активируемых флуоресценцией отдельных клеток. Затем эти клоны были последовательно размножены в 1, 2, а затем в 30 мл среды E в 48-луночные планшеты (номер по каталогу 3548; Corning), 12-луночные планшеты (номер по каталогу 3513; Corning) и Т-75- см 2 колбы (каталожный номер.430641; Corning) соответственно. Для каждой колбы T-75-cm 2 клетки соскабливали и размножали в четырех колбах T-225-cm 2 (номер по каталогу 431082; Corning) в 250 мл бессывороточной среды (Hybridoma-SFM , каталожный номер 12045-076; Gibco). Через 21 день при 37 ° C супернатанты фильтровали с использованием фильтра с размером пор 0,2 мкм. Антитела очищали из фильтрата с использованием колонок HiTrap с белком G или HiTrap MabSelectSure (каталожные номера 17040501 и 11003494 соответственно; GE Healthcare Life Sciences).

    Скрининг ELISA. Растворимые формы полноразмерного внеклеточного домена вируса Эбола Заир (EBOV), вируса Bundibugyo (BDBV), суданского вируса (SUDV) и гликопротеинов (GPs) вируса Марбурга (MARV) (1 мкг / мл) или секретируемый EBOV GP (sGP) (1 мкг / мл) разводили в 1 × забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко без кальция и магния (D-PBS) для покрытия 384-луночных планшетов для ELISA (каталожный номер 265203; Thermo Scientific) при 25 ° C. мкл / лунку и инкубируют при 4 ° C в течение ночи. Планшеты промывали 3 × D-PBS-T (1 × D-PBS плюс 0.05% Tween 20) и заблокировали в течение 1 ч при комнатной температуре блокирующим раствором (1% обезжиренное сухое молоко [блокатор блоттинга, номер по каталогу 170-6404; Bio-Rad], 1% козья сыворотка [номер по каталогу 16210- 072; Gibco] в D-PBS-T). После блокирования планшеты затем промывали 3 × D-PBS-T и добавляли 10 мкл / лунку супернатанта из лунок, содержащих В-клетки, трансформированные EBV. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем промывали 3 раза D-PBS-T. Раствор вторичных антител (конъюгированные с козьим антителом к ​​человеческому Fc гамма-фрагменту щелочной фосфатазой [AP], каталожный №W99008A; Meridian Life Science) при разведении 1: 4000 в блокирующем растворе затем добавляли по 25 мкл / лунку в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляли раствор субстрата щелочной фосфатазы (таблетки субстрата фосфатазы [каталожный номер S0942; Sigma] в буфере субстрата АР (1 М трисаминометан [каталожный номер BP152-5; Fisher], 30 мМ MgCl2 [каталожный номер M1028; Sigma]). при 25 мкл / лунку после 6-кратной промывки планшета 1 × D-PBS-T. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 2 часов, затем считывали при оптической плотности 405 нм с помощью планшет-ридера Biotek.Реактивные лунки были выбраны на основе оптической плотности> 0,5 нм. Для визуализации данных использовался пакет программ Circos (26).

    Рекомбинантный гликопротеин. Для продукции рекомбинантных эктодоменов GP EBOV, BDBV, SUDV и MARV (аминокислоты с 1 по 636) и sGP EBOV (аминокислоты с 1 по 316) были созданы стабильные линии клеток S2 дрозофилы. Вкратце, реагент для трансфекции Effectene (Qiagen) использовали для трансфекции клеток S2 модифицированными векторными плазмидами pMTpuro, содержащими интересующий ген GP, с последующей стабильной селекцией трансфицированных клеток с 6 мкг / мл пуромицина в полной среде Шнайдера.Стабильные клетки переводили в среду Insect Xpress (Lonza) в шейкерной культуре, и экспрессию эктодомена GP индуцировали 0,5 мМ CuSO 4 . Супернатанты собирали через 4 дня. Все белки были сконструированы с двойной меткой стрептококка на С-конце для облегчения очистки с использованием смолы Strep-Tactin (Qiagen), а GP дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии Superdex 200 в трис-буферном физиологическом растворе (TBS) или буфере PBS.

    Вирусы и клетки. Анализы нейтрализации проводили с использованием вирусного запаса, содержащего вирус Эбола Заир (EBOV / Kik-9510621, CDC no.807224, Vero E6p2), который дополнительно пропускали в монослойных культурах клеток Vero один раз и в культурах монослоя клеток Vero E6 дважды (Vero E6p2, Vero p1, E6p2). Адаптированный к мышам вирус Эбола Заир (ma-ZEBOV) был приготовлен из исходного запаса Bray (штамм 1976 г., Mayinga) (27) с дополнительным пассажем на культурах монослоя клеток Vero E6 (Mp3, Vp2, Mp9, ppGH, Vp1). Для тестов нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT) был создан биологически содержащийся вирус Эбола, вирус EbolaΔVP30, как описано ранее, обладающий репортерным геном зеленого флуоресцентного белка (GFP) вместо открытой рамки считывания VP30 в вирусном геноме (28).Клетки VeroVP30 поддерживали в полной ростовой среде (10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 1 × минимальная необходимая среда [MEM] с антибиотиками и добавками), а вирус Эбола ΔVP30-GFP размножали в восстановленной среде (2% FBS, 1 × MEM с антибиотиками и добавками), как описано ранее (28). Вирусы EbolaΔVP30 были одобрены для использования в рамках защиты уровня 2 биологической безопасности в Университете Висконсина-Мэдисона Национальными институтами здравоохранения и CDC в феврале 2016 года.

    Полумаксимальная эффективная концентрация (EC 50 ), связывающая анализ ELISA.EBOV, BDBV, SUDV или MARV GP или EBOV sGP (1 мкг / мл) получали в 1 × D-PBS для покрытия 384-луночных планшетов для ELISA в количестве 25 мкл / лунку и инкубировали при 4 ° C в течение ночи. Планшеты промывали 3 раза D-PBS-T и блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре блокирующим раствором (1% обезжиренное сухое молоко, 1% козья сыворотка, D-PBS-T). После блокирования планшеты промывали 3 × D-PBS-T и добавляли 25 мкл / лунку 3-кратно серийно разведенных очищенных человеческих MAb EBOV (от 30 мкг / мл до 170 нг / мл) в блокирующем растворе. Раствор вторичных антител (конъюгированная с козьим антителом к ​​человеческому Fc гамма-фрагменту щелочной фосфатазой, каталожный №W99008A; Meridian Life Science) при разведении 1: 4000 в блокирующем растворе добавляли по 25 мкл / лунку в течение 1 ч при комнатной температуре. Раствор субстрата щелочной фосфатазы добавляли в количестве 25 мкл / лунку после 6-кратной промывки планшета D-PBS-T. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч, а затем считывали при оптической плотности 405 нм с помощью планшет-ридера Biotek. Значения EC 50 были рассчитаны с использованием нелинейного регрессионного анализа кривых, построенных в Prism версии 5 (программное обеспечение GraphPad).

    Анализ нейтрализации. Ответы нейтрализующих антител, специфичных к вирусу, титровали в тесте нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT), как описано ранее (2). Антитела серийно разводили в минимальной необходимой среде (Corning Cellgro, Manassas, VA), содержащей 5% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (Gibco-Invitrogen, Gaithersburg, MD), 1 × антибиотик-антимикотик (Gibco-Invitrogen) (MEM complete), и инкубировали 1 ч при 37 ° C с вирусом. После инкубации смесь антитело-вирус добавляли в двух экземплярах в 6-луночные планшеты, содержащие от 90 до 95% конфлюэнтных монослоев клеток Vero E6.Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C, осторожно покачивая каждые 15 мин. После инкубации лунки были покрыты 0,5% агарозой в дополненной минимальной базовой среде Игла (EBME), 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой (Gibco-Invitrogen) и 2х антибиотик-антимикотик (Gibco-Invitrogen) и планшеты. инкубировали при 37 ° C в 5% CO 2 в течение 7 дней. На 7 день клетки окрашивали добавлением второго верхнего слоя, приготовленного, как описано выше, содержащего от 4 до 5% нейтрального красного.Планшеты инкубировали от 18 до 24 ч при 37 ° C в 5% CO 2 . Титр конечной точки был определен как самое высокое разведение с уменьшением ≥50% или ≥80% (PRNT 50 или PRNT 80 , соответственно) количества бляшек, наблюдаемых в контрольных лунках, содержащих только вирусы.

    Тест нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT). Для определения нейтрализующей активности EBOV237 была проведена стандартная PRNT с вирусом EbolaΔVP30-GFP (28). Приблизительно 200 БОЕ вируса инкубировали с EBOV237 (серийные 10-кратные разведения антитела в восстановленной среде) или MAb VP35 в качестве контроля в течение 60 мин при 37 ° C.После инкубации проводили стандартные анализы бляшек (в трех повторностях), в которых смесь вирус-антитело инокулировали на монослои клеток VeroVP30 в течение 60 мин. После отмывания несвязавшегося вируса клетки покрывали 1,25% метилцеллюлозной средой и инкубировали в течение 7 дней. Клетки фиксировали, проводили иммуноокрашивание с использованием антитела против VP40, как описано ранее (28), и подсчитывали количество бляшек в каждой лунке.

    Получение мутантных вирусов, ускользающих от антител.Для создания мутантных вирусов, которые больше не нейтрализовались, приблизительно 10 000 БОЕ вируса Эбола ΔVP30-GFP инкубировали с 5 мкг / мл EBOV237 при 37 ° C в течение 60 мин. После инкубации смесь вирус-антитело инокулировали в клетки VeroVP30 и инкубировали в течение 60 мин при 37 ° C, а после инкубации клетки трижды промывали восстановленной средой. Любые ускользнувшие мутантные вирусы размножали в течение 9 дней в восстановленной среде, содержащей 5 мкг / мл MAb EBOV237. Четыре отдельных ускользающих мутантных вируса были выделены путем отбора устойчивых бляшек (28), и запасы вируса были созданы для каждого ускользающего мутантного вируса в восстановленной среде в присутствии EBOV237 (5 мкг / мл).Последовательность вируса GP определяли с использованием вирусной РНК, выделенной из супернатанта клеточной культуры исходного вируса (RNeasy minikit; Qiagen). ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR; Verso 1-Step RT-PCR kit; Thermo Fisher Scientific) была проведена для амплификации вирусного гена GP с использованием прямого и обратного праймеров в положениях 6000 и 8110 вируса Эбола Заира (штамм Mayinga 1976). ) геном, фланкирующий 5 ‘и 3’ открытые рамки считывания гена GP, соответственно. Полученный продукт ОТ-ПЦР клонировали тупым концом в вектор TOPO pCR-XL (Thermo Fisher Scientific), и последовательность GP определяли методом секвенирования ДНК Сэнгера для плазмидной ДНК от 10 до 20 бактериальных клонов для каждого мутанта, ускользнувшего от вируса. .

    Анализ конкурентного связывания с использованием биослойной интерферометрии. Для экспериментов по конкурентному связыванию EBOV GP или EBOV sGP биотинилировали с использованием набора для биотинилирования EZ-link Micro NHS-PEG 4 (каталожный номер 21955; Thermo Scientific). Биосенсоры замачивали на 10 мин в 200 мкл 1 × кинетического буфера (номер по каталогу 18-1092; ForteBio) с последующим измерением базового сигнала в течение 60 с. Затем биотинилированные белки (5 мкг / мл) иммобилизовали на покрытых стрептавидином наконечниках биосенсоров (каталожный номер.18-5019; ForteBio) на 120 с. После промывки наконечников биосенсоров путем погружения в 1-кратный кинетический буфер на 60 с биосенсоры погружали в 1-кратный кинетический буфер, содержащий первое антитело (100 мкг / мл), на 600 с. Затем наконечники погружали в кинетический буфер, содержащий второе антитело (100 мкг / мл), на 300 с. Сравнение максимального сигнала второго антитела в отсутствие или в присутствии первого антитела использовали для определения процента связывания второго антитела. Если процент связывания второго антитела снижался до <30% от максимального сигнала, который имел место в отсутствие первого антитела, считалось, что антитела демонстрируют полную конкуренцию за связывание.Если процент связывания снижался с 30% до 70% от максимального сигнала, который имел место в отсутствие первого антитела, считалось, что антитела демонстрируют промежуточную конкуренцию за связывание. Если процент связывания составлял> 70% от максимального сигнала, который имел место в отсутствие первого антитела, антитела считались неконкурентными.

    Производство

    Fab. Для создания Fab-фрагмента EBOV237 очищенный белок MAb IgG расщепляли папаином (маточный раствор 0,1 мг / мл, каталожный номер.P3125; Sigma) в соотношении 20: 1 (вес: вес) МАb-папаин. Переваривание проводили при 37 ° C в течение 1 ч перед прекращением путем добавления 1/10 объема 0,3 М йодацетамида в PBS с последующим немедленным 10-кратным разведением в 10% нормальной козьей сыворотке (NGS) и хранением при 4 ° C. .

    Аланин-сканирующий мутагенез дробовика для картирования эпитопов. Мы создали библиотеку аланин-сканирующего мутагенеза для EBOV GP (18), используя конструкцию экспрессии EBOV GPΔmucin (вирус Эбола H.sapiens-tc / COD / 1976 / Yambuku-Mayinga [23] ], Δ311–461).Каждый из аминокислотных остатков 33-310 и 462-676 муцина GPD EBOV заменяли в отдельных конструкциях GP по одному на аланин (или остатки аланина на серин). Последовательность сигнального пептида, остатки от 1 до 32, не изменилась. Клоны библиотеки мутагенеза со сканирующим аланином составляли 99,9% целевых остатков (492 из 493), и наличие мутаций было подтверждено секвенированием ДНК. Клоны помещали по одному мутанту на лунку в 384-луночные планшеты. Клетки HEK-293T трансфицировали мутантной библиотекой.После 22 ч инкубации, чтобы обеспечить экспрессию мутантных GP, клетки либо фиксировали 4% параформальдегидом в PBS с кальцием и магнием, либо не фиксировали. Затем клетки инкубировали с Fab-фрагментом EBOV237 в 10% нормальной козьей сыворотке (NGS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавляли вторичное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), в 10% NGS, и клетки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.Затем клетки дважды промывали PBS без кальция и магния и ресуспендировали в Cellstripper (Cellgro, Manassas, VA) с 0,1% BSA (Sigma-Aldrich). Затем для обнаружения клеточной флуоресценции использовали многолуночный автоматический проточный цитометр (HTFC; Intellicyt, Albuquerque, NM). Относительную реактивность Fab-фрагмента EBOV237 к мутантам по сравнению с GPΔmucin EBOV дикого типа определяли вычитанием фонового сигнала, подаваемого контрольными клетками, трансфицированными ложным вектором, и нормализацией сигнала к контролю, трансфицированному GPΔmucin EBOV дикого типа.Критические клоны определяли, если они не связывали Fab-фрагмент EBOV237, но связывали другие контрольные MAb EBOV (EBOV296, EBOV442 и EBOV520). Этот подход исключает мутанты с неправильной упаковкой или дефектами экспрессии (29). Данные мутагенеза анализировали с помощью подробных алгоритмов, как описано ранее (30).

    Исследования защиты in vivo . Все исследования на животных проводились в соответствии с утвержденным IACUC протоколом в соответствии с Законом о благополучии животных, Политикой PHS и другими федеральными законами и постановлениями, касающимися животных и экспериментов с животными.Учреждение, где проводилось это исследование, аккредитовано Международной ассоциацией по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными и придерживается принципов, изложенных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, Национальный исследовательский совет, 2011 г. Самки мышей BALB / c , возраст от 6 до 8 недель, были приобретены в Charles River Laboratories. По прибытии мышей помещали в клетки-микроизоляторы в зоне содержания животных с уровнем биобезопасности 4, и им давали пищу и воду ad libitum .Первоначальное исследование оценивало эффективность EBOV237 в одной концентрации. За 24 часа до заражения (день -1) группы мышей (10 мышей в группе) обрабатывали внутрибрюшинно (i.p.) однократной дозой (100 мкг) антитела. Мыши отрицательного контроля получали нерелевантное антитело IgG. Мыши положительного контроля получали 100 мкг ранее описанного MAb 13C6. В день 0 мышей инокулировали i.p. трасса со 100 БОЕ ма-ЗЕБОВ. За мышами наблюдали ежедневно (дважды в день, если были отмечены клинические признаки заболевания) в течение 28 дней после инокуляции вируса.Вес групп регистрировали ежедневно после инокуляции вируса. Вес тела рассчитывали путем деления веса группы на количество взвешенных мышей. Во втором исследовании эффективность оценивалась при различных уменьшающихся дозах. Для этого исследования мышам ( n = 10 / группа) вводили однократную дозу 200, 100, 50 или 25 мкг EBOV237 за 24 часа до воздействия вируса. Мыши отрицательного контроля получали нерелевантное антитело IgG. Мыши положительного контроля получали однократную дозу 100 мкг MAb 13C6. В день d0 мышей инокулировали i.п. трасса со 100 БОЕ ма-ЗЕБОВ. За мышами наблюдали ежедневно (дважды в день, если были клинические признаки заболевания) в течение 21 дня после инокуляции вируса. Вес групп регистрировали ежедневно после инокуляции вируса. Вес тела рассчитывали путем деления веса группы на количество взвешенных мышей.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Мы благодарим команду Эмори по серьезным инфекционным заболеваниям за их усилия по сбору образцов у этих пациентов и сотрудников лаборатории Рафи Ахмеда в Эмори, которые отделили и заморозили выжившие PBMC.Мы благодарим Ханну Кинг, Ребекку Лампли и Гопал Саппарапу за техническую поддержку с препаратом белка антитела.

    Эта работа была поддержана грантами NIH США U19 AI109711 (для JEC) и U19 AI109762 (для EOS), грантом Агентства по снижению угрозы HDTRA1-13-1-0034 (для JEC), контрактом HHS HHSN272201400058C (для JEC и BJD) , и грант Агентства перспективных исследовательских проектов Министерства обороны США W31P4Q-14-1-0010 (JEC и YK). Эксперименты по проточной цитометрии были выполнены в VUMC Flow Cytometry Shared Resource, поддержанном грантами NIH P30 CA68485 и DK058404.

    L.E.W., A.I.F., P.J.G. Y.K. и J.E.C. запланировал исследования. L.E.W., A.I.F., N.K., R.B., S.R., E.D., M.L.F., E.O.S, P.J.H., A.E.P. и P.J.G. провели эксперименты. А.Б. сгенерировал графики Circos. L.E.W., E.D., B.J.D., P.J.H, Y.K, P.J.G. и J.E.C. интерпретировал исследования. L.E.W. и J.E.C. написал первый черновик статьи. E.O.S., B.J.D., Y.K., P.J.G. и J.E.C. получено финансирование.

    S.R., E.D. и B.D. являются сотрудниками Integral Molecular. B.J.D. является акционером Integral Molecular.J.E.C. является консультантом Sanofi, входит в состав научных консультативных советов PaxVax, CompuVax, GigaGen и Meissa Vaccines, является получателем предыдущих грантов на исследования от Moderna и Sanofi, а также является основателем IDBiologics. Все остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов. Авторы несут полную ответственность за содержание этой статьи, которое не обязательно отражает официальную точку зрения NIH или DOD.

    СНОСКИ

      • Поступило 27 сентября 2018 г.
      • Принято 21 января 2019 г.
      • Принято рукопись размещена в Интернете 6 февраля 2019 г.
    • Авторские права © Американское общество микробиологии, 2019 г.

    SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

    Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

    Укажите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, чтобы он включал информацию о компании.

    Чтобы узнать о передовых методах эффективной загрузки информации с SEC.gov, в том числе о последних документах EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации свяжитесь с opendata @ sec.губ.

    Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

    Код ссылки: 0.4685655f.1621813758.fd40334

    Дополнительная информация

    Политика безопасности в Интернете

    Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная служба оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

    Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 USC §§ 1001 и 1030).

    Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других пользователей к SEC.содержание правительства. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

    Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период. Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.губ. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

    Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

    Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

    Text — S.482 — 116-й Конгресс (2019-2020): Защита американской безопасности от Акта об агрессии Кремля от 2019 года | Конгресс.gov

    Секция записи Конгресса Ежедневный дайджест Сенат жилой дом Расширения замечаний

    Замечания участников Автор: Any House Member Адамс, Альма С.[D-NC] Адерхольт, Роберт Б. [R-AL] Агилар, Пит [D-CA] Аллен, Рик В. [R-GA] Оллред, Колин З. [D-TX] Амодеи, Марк Э. [R -NV] Армстронг, Келли [R-ND] Аррингтон, Джоди К. [R-TX] Auchincloss, Jake [D-MA] Axne, Cynthia [D-IA] Бабин, Брайан [R-TX] Бэкон, Дон [R -NE] Бэрд, Джеймс Р. [R-IN] Балдерсон, Трой [R-OH] Бэнкс, Джим [R-IN] Барр, Энди [R-KY] Барраган, Нанетт Диас [D-CA] Басс, Карен [ D-CA] Битти, Джойс [D-OH] Бенц, Клифф [R-OR] Бера, Ami [D-CA] Бергман, Джек [R-MI] Бейер, Дональд С., младший [D-VA] Байс , Стефани И. [R-OK] Биггс, Энди [R-AZ] Билиракис, Гас М.[R-FL] Бишоп, Дэн [R-NC] Бишоп, Сэнфорд Д., младший [D-GA] Блуменауэр, Эрл [D-OR] Блант Рочестер, Лиза [D-DE] Боберт, Лорен [R-CO ] Бонамичи, Сюзанна [D-OR] Бост, Майк [R-IL] Bourdeaux, Carolyn [D-GA] Bowman, Jamaal [D-NY] Бойл, Брендан Ф. [D-PA] Брэди, Кевин [R-TX ] Брукс, Мо [R-AL] Браун, Энтони Г. [D-MD] Браунли, Джулия [D-CA] Бьюкенен, Верн [R-FL] Бак, Кен [R-CO] Бакшон, Ларри [R-IN ] Бадд, Тед [R-NC] Берчетт, Тим [R-TN] Берджесс, Майкл К. [R-TX] Буш, Кори [D-MO] Бустос, Cheri [D-IL] Баттерфилд, GK [D-NC ] Калверт, Кен [R-CA] Каммак, Кэт [R-FL] Карбаджал, Салуд О.[D-CA] Карденас, Тони [D-CA] Карл, Джерри Л. [R-AL] Карсон, Андре [D-IN] Картер, Эрл Л. «Бадди» [R-GA] Картер, Джон Р. [ R-TX] Картер, Трой [D-LA] Картрайт, Мэтт [D-PA] Кейс, Эд [D-HI] Кастен, Шон [D-IL] Кастор, Кэти [D-FL] Кастро, Хоакин [D- TX] Cawthorn, Мэдисон [R-NC] Chabot, Стив [R-OH] Чейни, Лиз [R-WY] Чу, Джуди [D-CA] Cicilline, Дэвид Н. [D-RI] Кларк, Кэтрин М. [ D-MA] Кларк, Иветт Д. [D-NY] Кливер, Эмануэль [D-MO] Клайн, Бен [R-VA] Клауд, Майкл [R-TX] Клайберн, Джеймс Э. [D-SC] Клайд, Эндрю С. [R-GA] Коэн, Стив [D-TN] Коул, Том [R-OK] Комер, Джеймс [R-KY] Коннолли, Джеральд Э.[D-VA] Купер, Джим [D-TN] Корреа, Дж. Луис [D-CA] Коста, Джим [D-CA] Кортни, Джо [D-CT] Крейг, Энджи [D-MN] Кроуфорд, Эрик А. «Рик» [R-AR] Креншоу, Дэн [R-TX] Крист, Чарли [D-FL] Кроу, Джейсон [D-CO] Куэльяр, Генри [D-TX] Кертис, Джон Р. [R- UT] Дэвидс, Шарис [D-KS] Дэвидсон, Уоррен [R-OH] Дэвис, Дэнни К. [D-IL] Дэвис, Родни [R-IL] Дин, Мадлен [D-PA] ДеФазио, Питер А. [ D-OR] DeGette, Diana [D-CO] DeLauro, Rosa L. [D-CT] DelBene, Suzan K. [D-WA] Delgado, Antonio [D-NY] Demings, Val Butler [D-FL] DeSaulnier , Марк [D-CA] ДеДжарле, Скотт [R-TN] Дойч, Теодор Э.[D-FL] Диас-Баларт, Марио [R-FL] Дингелл, Дебби [D-MI] Доггетт, Ллойд [D-TX] Дональдс, Байрон [R-FL] Дойл, Майкл Ф. [D-PA] Дункан , Джефф [R-SC] Данн, Нил П. [R-FL] Эммер, Том [R-MN] Эскобар, Вероника [D-TX] Эшу, Анна Г. [D-CA] Эспайлат, Адриано [D-NY ] Эстес, Рон [R-KS] Эванс, Дуайт [D-PA] Фэллон, Пэт [R-TX] Feenstra, Рэнди [R-IA] Фергюсон, А. Дрю, IV [R-GA] Фишбах, Мишель [R -MN] Фицджеральд, Скотт [R-WI] Фитцпатрик, Брайан К. [R-PA] Флейшманн, Чарльз Дж. «Чак» [R-TN] Флетчер, Лиззи [D-TX] Фортенберри, Джефф [R-NE] Фостер, Билл [D-IL] Фокс, Вирджиния [R-NC] Франкель, Лоис [D-FL] Франклин, К.Скотт [R-FL] Фадж, Марсия Л. [D-OH] Фулчер, Расс [R-ID] Gaetz, Мэтт [R-FL] Галлахер, Майк [R-WI] Галлего, Рубен [D-AZ] Гараменди, Джон [D-CA] Гарбарино, Эндрю Р. [R-NY] Гарсия, Хесус Дж. «Чуй» [D-IL] Гарсия, Майк [R-CA] Гарсия, Сильвия Р. [D-TX] Гиббс, Боб [R-OH] Хименес, Карлос А. [R-FL] Гомерт, Луи [R-TX] Голден, Джаред Ф. [D-ME] Гомес, Джимми [D-CA] Гонсалес, Тони [R-TX] Гонсалес , Энтони [R-OH] Гонсалес, Висенте [D-TX] Гонсалес-Колон, Дженниффер [R-PR] Гуд, Боб [R-VA] Гуден, Лэнс [R-TX] Госар, Пол А. [R-AZ ] Gottheimer, Джош [D-NJ] Granger, Kay [R-TX] Graves, Garret [R-LA] Graves, Sam [R-MO] Green, Al [D-TX] Green, Mark E.[R-TN] Грин, Марджори Тейлор [R-GA] Гриффит, Х. Морган [R-VA] Гриджалва, Рауль М. [D-AZ] Гротман, Гленн [R-WI] Гость, Майкл [R-MS] Гатри, Бретт [R-KY] Хааланд, Дебра А. [D-NM] Хагедорн, Джим [R-MN] Хардер, Джош [D-CA] Харрис, Энди [R-MD] Харшбаргер, Диана [R-TN] Хартцлер, Вики [R-MO] Гастингс, Элси Л. [D-FL] Хейс, Джахана [D-CT] Херн, Кевин [R-OK] Херрелл, Иветт [R-NM] Эррера Бейтлер, Хайме [R-WA ] Хайс, Джоди Б. [R-GA] Хиггинс, Брайан [D-NY] Хиггинс, Клэй [R-LA] Хилл, Дж. Френч [R-AR] Хаймс, Джеймс А. [D-CT] Хинсон, Эшли [R-IA] Hollingsworth, Trey [R-IN] Horsford, Steven [D-NV] Houlahan, Chrissy [D-PA] Hoyer, Steny H.[D-MD] Хадсон, Ричард [R-NC] Хаффман, Джаред [D-CA] Хьюизенга, Билл [R-MI] Исса, Даррелл Э. [R-CA] Джексон, Ронни [R-TX] Джексон Ли, Шейла [D-TX] Джейкобс, Крис [R-NY] Джейкобс, Сара [D-CA] Jayapal, Pramila [D-WA] Джеффрис, Хаким С. [D-NY] Джонсон, Билл [R-OH] Джонсон, Дасти [R-SD] Джонсон, Эдди Бернис [D-TX] Джонсон, Генри К. «Хэнк» младший [D-GA] Джонсон, Майк [R-LA] Джонс, Mondaire [D-NY] Джордан, Джим [R-OH] Джойс, Дэвид П. [R-OH] Джойс, Джон [R-PA] Кахеле, Кайали [D-HI] Каптур, Марси [D-OH] Катко, Джон [R-NY] Китинг , Уильям Р.[D-MA] Келлер, Фред [R-PA] Келли, Майк [R-PA] Келли, Робин Л. [D-IL] Келли, Трент [R-MS] Кханна, Ро [D-CA] Килди, Дэниел Т. [D-MI] Килмер, Дерек [D-WA] Ким, Энди [D-NJ] Ким, Янг [R-CA] Кинд, Рон [D-WI] Кинзингер, Адам [R-IL] Киркпатрик, Энн [D-AZ] Кришнамурти, Раджа [D-IL] Кустер, Энн М. [D-NH] Кустофф, Дэвид [R-TN] Лахуд, Дарин [R-IL] Ламальфа, Дуг [R-CA] Лэмб, Конор [D-PA] Лэмборн, Дуг [R-CO] Ланжевен, Джеймс Р. [D-RI] Ларсен, Рик [D-WA] Ларсон, Джон Б. [D-CT] Латта, Роберт Э. [R-OH ] Латернер, Джейк [R-KS] Лоуренс, Бренда Л.[D-MI] Лоусон, Эл, младший [D-FL] Ли, Барбара [D-CA] Ли, Сьюзи [D-NV] Леже Фернандес, Тереза ​​[D-NM] Леско, Дебби [R-AZ] Летлоу , Джулия [R-LA] Левин, Энди [D-MI] Левин, Майк [D-CA] Льеу, Тед [D-CA] Лофгрен, Зои [D-CA] Лонг, Билли [R-MO] Лоудермилк, Барри [R-GA] Ловенталь, Алан С. [D-CA] Лукас, Фрэнк Д. [R-OK] Люткемейер, Блейн [R-MO] Лурия, Элейн Г. [D-VA] Линч, Стивен Ф. [D -MA] Мейс, Нэнси [R-SC] Малиновски, Том [D-NJ] Маллиотакис, Николь [R-NY] Мэлони, Кэролин Б. [D-NY] Мэлони, Шон Патрик [D-NY] Манн, Трейси [ R-KS] Мэннинг, Кэти Э.[D-NC] Мэсси, Томас [R-KY] Маст, Брайан Дж. [R-FL] Мацуи, Дорис О. [D-CA] МакБэт, Люси [D-GA] Маккарти, Кевин [R-CA] МакКол , Майкл Т. [R-TX] Макклейн, Лиза К. [R-MI] МакКлинток, Том [R-CA] МакКоллум, Бетти [D-MN] МакИчин, А. Дональд [D-VA] Макговерн, Джеймс П. [D-MA] МакГенри, Патрик Т. [R-NC] МакКинли, Дэвид Б. [R-WV] МакМоррис Роджерс, Кэти [R-WA] Макнерни, Джерри [D-CA] Микс, Грегори В. [D- NY] Мейер, Питер [R-MI] Мэн, Грейс [D-NY] Meuser, Daniel [R-PA] Mfume, Kweisi [D-MD] Миллер, Кэрол Д. [R-WV] Миллер, Мэри Э. [ R-IL] Миллер-Микс, Марианнетт [R-IA] Мооленаар, Джон Р.[R-MI] Муни, Александр X. [R-WV] Мур, Барри [R-AL] Мур, Блейк Д. [R-UT] Мур, Гвен [D-WI] Морелль, Джозеф Д. [D-NY ] Моултон, Сет [D-MA] Мрван, Фрэнк Дж. [D-IN] Маллин, Маркуэйн [R-OK] Мерфи, Грегори [R-NC] Мерфи, Стефани Н. [D-FL] Надлер, Джерролд [D -NY] Наполитано, Грейс Ф. [D-CA] Нил, Ричард Э. [D-MA] Негусе, Джо [D-CO] Нелс, Трой Э. [R-TX] Ньюхаус, Дэн [R-WA] Ньюман , Мари [D-IL] Норкросс, Дональд [D-NJ] Норман, Ральф [R-SC] Нортон, Элеонора Холмс [D-DC] Нуньес, Девин [R-CA] О’Халлеран, Том [D-AZ] Обернолти, Джей [R-CA] Окасио-Кортес, Александрия [D-NY] Омар, Ильхан [D-MN] Оуэнс, Берджесс [R-UT] Палаццо, Стивен М.[R-MS] Паллоне, Фрэнк, младший [D-NJ] Палмер, Гэри Дж. [R-AL] Панетта, Джимми [D-CA] Паппас, Крис [D-NH] Паскрелл, Билл, мл. [D -NJ] Пейн, Дональд М., младший [D-NJ] Пелоси, Нэнси [D-CA] Пенс, Грег [R-IN] Перлмуттер, Эд [D-CO] Перри, Скотт [R-PA] Петерс, Скотт Х. [D-CA] Пфлюгер, Август [R-TX] Филлипс, Дин [D-MN] Пингри, Челли [D-ME] Пласкетт, Стейси Э. [D-VI] Покан, Марк [D-WI] Портер, Кэти [D-CA] Поузи, Билл [R-FL] Прессли, Аянна [D-MA] Прайс, Дэвид Э. [D-NC] Куигли, Майк [D-IL] Радваген, Аумуа Амата Коулман [R- AS] Раскин, Джейми [D-MD] Рид, Том [R-NY] Решенталер, Гай [R-PA] Райс, Кэтлин М.[D-NY] Райс, Том [R-SC] Ричмонд, Седрик Л. [D-LA] Роджерс, Гарольд [R-KY] Роджерс, Майк Д. [R-AL] Роуз, Джон В. [R-TN ] Розендейл старший, Мэтью М. [R-MT] Росс, Дебора К. [D-NC] Роузер, Дэвид [R-NC] Рой, Чип [R-TX] Ройбал-Аллард, Люсиль [D-CA] Руис , Рауль [D-CA] Рупперсбергер, Калифорния Датч [D-MD] Раш, Бобби Л. [D-IL] Резерфорд, Джон Х. [R-FL] Райан, Тим [D-OH] Саблан, Грегорио Килили Камачо [ D-MP] Салазар, Мария Эльвира [R-FL] Санчес, Линда Т. [D-CA] Сан-Николас, Майкл FQ [D-GU] Сарбейнс, Джон П. [D-MD] Скализ, Стив [R-LA ] Скэнлон, Мэри Гей [D-PA] Шаковски, Дженис Д.[D-IL] Шифф, Адам Б. [D-CA] Шнайдер, Брэдли Скотт [D-IL] Шрейдер, Курт [D-OR] Шриер, Ким [D-WA] Швейкерт, Дэвид [R-AZ] Скотт, Остин [R-GA] Скотт, Дэвид [D-GA] Скотт, Роберт С. «Бобби» [D-VA] Сешнс, Пит [R-TX] Сьюэлл, Терри А. [D-AL] Шерман, Брэд [D -CA] Шерилл, Мики [D-NJ] Симпсон, Майкл К. [R-ID] Sires, Альбио [D-NJ] Slotkin, Элисса [D-MI] Смит, Адам [D-WA] Смит, Адриан [R -NE] Смит, Кристофер Х. [R-NJ] Смит, Джейсон [R-MO] Смакер, Ллойд [R-PA] Сото, Даррен [D-FL] Спанбергер, Эбигейл Дэвис [D-VA] Спарц, Виктория [ R-IN] Шпейер, Джеки [D-CA] Стэнтон, Грег [D-AZ] Стаубер, Пит [R-MN] Стил, Мишель [R-CA] Стефаник, Элиза М.[R-NY] Стейл, Брайан [R-WI] Steube, В. Грегори [R-FL] Стивенс, Хейли М. [D-MI] Стюарт, Крис [R-UT] Стиверс, Стив [R-OH] Стрикленд , Мэрилин [D-WA] Суоззи, Томас Р. [D-NY] Swalwell, Эрик [D-CA] Такано, Марк [D-CA] Тейлор, Ван [R-TX] Тенни, Клаудия [R-NY] Томпсон , Бенни Г. [D-MS] Томпсон, Гленн [R-PA] Томпсон, Майк [D-CA] Тиффани, Томас П. [R-WI] Тиммонс, Уильям Р. IV [R-SC] Титус, Дина [ D-NV] Тлаиб, Рашида [D-MI] Тонко, Пол [D-NY] Торрес, Норма Дж. [D-CA] Торрес, Ричи [D-NY] Трахан, Лори [D-MA] Трон, Дэвид Дж. .[D-MD] Тернер, Майкл Р. [R-OH] Андервуд, Лорен [D-IL] Аптон, Фред [R-MI] Валадао, Дэвид Г. [R-CA] Ван Дрю, Джефферсон [R-NJ] Ван Дайн, Бет [R-TX] Варгас, Хуан [D-CA] Визи, Марк А. [D-TX] Вела, Филемон [D-TX] Веласкес, Нидия М. [D-NY] Вагнер, Ann [R -MO] Уолберг, Тим [R-MI] Валорски, Джеки [R-IN] Вальс, Майкл [R-FL] Вассерман Шульц, Дебби [D-FL] Уотерс, Максин [D-CA] Уотсон Коулман, Бонни [D -NJ] Вебер, Рэнди К., старший [R-TX] Вебстер, Дэниел [R-FL] Велч, Питер [D-VT] Венструп, Брэд Р. [R-OH] Вестерман, Брюс [R-AR] Векстон, Дженнифер [D-VA] Уайлд, Сьюзан [D-PA] Уильямс, Nikema [D-GA] Уильямс, Роджер [R-TX] Уилсон, Фредерика С.[D-FL] Уилсон, Джо [R-SC] Виттман, Роберт Дж. [R-VA] Womack, Стив [R-AR] Райт, Рон [R-TX] Ярмут, Джон А. [D-KY] Янг , Дон [R-AK] Зельдин, Ли М. [R-NY] Любой член Сената Болдуин, Тэмми [D-WI] Баррассо, Джон [R-WY] Беннет, Майкл Ф. [D-CO] Блэкберн, Марша [ R-TN] Блюменталь, Ричард [D-CT] Блант, Рой [R-MO] Букер, Кори А. [D-NJ] Бузман, Джон [R-AR] Браун, Майк [R-IN] Браун, Шеррод [ D-OH] Берр, Ричард [R-NC] Кантуэлл, Мария [D-WA] Капито, Шелли Мур [R-WV] Кардин, Бенджамин Л. [D-MD] Карпер, Томас Р. [D-DE] Кейси , Роберт П., Младший [D-PA] Кэссиди, Билл [R-LA] Коллинз, Сьюзан М. [R-ME] Кунс, Кристофер А. [D-DE] Корнин, Джон [R-TX] Кортез Масто, Кэтрин [D -NV] Коттон, Том [R-AR] Крамер, Кевин [R-ND] Крапо, Майк [R-ID] Круз, Тед [R-TX] Дейнс, Стив [R-MT] Дакворт, Тэмми [D-IL ] Дурбин, Ричард Дж. [D-IL] Эрнст, Джони [R-IA] Файнштейн, Dianne [D-CA] Фишер, Деб [R-NE] Гиллибранд, Кирстен Э. [D-NY] Грэм, Линдси [R -SC] Грассли, Чак [R-IA] Хагерти, Билл [R-TN] Харрис, Камала Д. [D-CA] Хассан, Маргарет Вуд [D-NH] Хоули, Джош [R-MO] Генрих, Мартин [ D-NM] Гикенлупер, Джон В.[D-CO] Хироно, Мази К. [D-HI] Хувен, Джон [R-ND] Хайд-Смит, Синди [R-MS] Инхоф, Джеймс М. [R-OK] Джонсон, Рон [R-WI ] Кейн, Тим [D-VA] Келли, Марк [D-AZ] Кеннеди, Джон [R-LA] Кинг, Ангус С., младший [I-ME] Klobuchar, Amy [D-MN] Ланкфорд, Джеймс [ R-OK] Лихи, Патрик Дж. [D-VT] Ли, Майк [R-UT] Леффлер, Келли [R-GA] Лухан, Бен Рэй [D-NM] Ламмис, Синтия М. [R-WY] Манчин , Джо, III [D-WV] Марки, Эдвард Дж. [D-MA] Маршалл, Роджер В. [R-KS] МакКоннелл, Митч [R-KY] Менендес, Роберт [D-NJ] Меркли, Джефф [D -ИЛИ] Моран, Джерри [R-KS] Мурковски, Лиза [R-AK] Мерфи, Кристофер [D-CT] Мюррей, Пэтти [D-WA] Оссофф, Джон [D-GA] Падилья, Алекс [D-CA ] Пол, Рэнд [R-KY] Питерс, Гэри К.[D-MI] Портман, Роб [R-OH] Рид, Джек [D-RI] Риш, Джеймс Э. [R-ID] Ромни, Митт [R-UT] Розен, Джеки [D-NV] Раундс, Майк [R-SD] Рубио, Марко [R-FL] Сандерс, Бернард [I-VT] Sasse, Бен [R-NE] Schatz, Брайан [D-HI] Шумер, Чарльз Э. [D-NY] Скотт, Рик [R-FL] Скотт, Тим [R-SC] Шахин, Жанна [D-NH] Шелби, Ричард К. [R-AL] Синема, Кирстен [D-AZ] Смит, Тина [D-MN] Стабеноу, Дебби [D-MI] Салливан, Дэн [R-AK] Тестер, Джон [D-MT] Тьюн, Джон [R-SD] Тиллис, Том [R-NC] Туми, Пэт [R-PA] Тубервиль, Томми [R -AL] Ван Холлен, Крис [D-MD] Уорнер, Марк Р.[D-VA] Варнок, Рафаэль Г. [D-GA] Уоррен, Элизабет [D-MA] Уайтхаус, Шелдон [D-RI] Уикер, Роджер Ф. [R-MS] Уайден, Рон [D-OR] Янг , Тодд [R-IN]

    Флавоноид 4,4′-диметоксихалкон способствует зависимому от аутофагии долголетию у всех видов

    Реагенты

    Следующие реагенты были приобретены у указанных поставщиков: меченый FITC аннексин V (Roche Applied Science [11828681001]), дигидроэтидиум (DHE, Sighdroethidium -Aldrich, [D7008]), иодид пропидия (PI, Sigma-Aldrich [P4170]), 4,4′-диметоксихалкон (DMC; ABCR, [AB179040]; Extrasynthese, [1295]; Sigma-Aldrich, [S617237]) , рапамицин (лаборатории LC, [R-5000]), ресвератрол (Sigma-Aldrich [R5010]).Для первоначального дрожжевого скрининга все флавоноиды (включая 4,4′-диметоксихалкон) были приобретены у Extrasynthese; Полный список, включающий название, подкласс и номер статьи каждого флавоноида, см. в дополнительной таблице 1. Исходные растворы флавоноидов всегда были свежеприготовленными в ДМСО перед обработкой. Ацетонитрил (Chromasolv), муравьиная кислота (Puriss), этилацетат (Chromasolv) были приобретены у Sigma Aldrich (St Lois, США). Воду очищали с помощью системы MilliQ (<18,2 МОм · см, Merck, Дармштадт, Германия).

    Дрожжевые штаммы и плазмиды

    Эксперименты проводили на BY4742 (MATα his3 Δ 1 leu2 Δ 0 lys2 Δ 0 ura3 Δ 0 ) и соответствующих нуль-мутантах, полученных от Euroscar. генерируется (дополнительная таблица 3), как описано ниже. Для мониторинга субклеточной локализации эндогенного Atg8 был использован ранее описанный штамм, экспрессирующий слитый белок EGFP-Atg8 52 . Экспрессию белка Atg определяли с использованием штаммов, меченных хромосомой 6 (НА), созданных с использованием pYM17 в качестве матрицы 53 .Все штаммы выращивали на среде SC, содержащей 0,17% азотистого основания дрожжей (BD Diagnostics, Schwechat, Австрия), 0,5% (NH 4 ) 2 SO 4 , 30 мг / л всех аминокислот (кроме 80 мг / л гистидина и 200 мг / л лейцина), 30 мг / л аденина и 320 мг / л урацила с 2% глюкозы (SCD). Для экспериментов по комплементации с Gln3, то есть для эписомальной экспрессии Gln3, клетки выращивали на SCD, как описано ниже, и после обработки флавоноидами добавляли галактозу до конечной концентрации 0.1%, чтобы вызвать экспрессию. Успешная экспрессия была проверена с помощью вестерн-блоттинга; Обратите внимание, что полученная двойная полоса (дополнительный рис. 8f) характерна для Gln3 54 .

    Эксперименты по хронологическому старению дрожжей

    Эксперименты по хронологическому старению проводили в 96-луночных планшетах (Bel-Art Products, США), запечатанных газопроницаемыми адгезивными мембранами (Excel Scientific) и крышками. Следовательно, 500 мкл свежей среды инокулировали ночными культурами из клеточного материала планшета YEPD, инкубированного в течение 4 дней, до OD 600 , равного 0.1 (~ 1,10 6 клеток мл –1 ). Таким образом, лунки на внешних краях планшетов с глубокими лунками не были засеяны, поскольку они склонны к высыханию в процессе старения; вместо этого они были загружены водой. Затем клетки выращивали до OD 600 ~ 0,2 и затем добавляли либо указанную концентрацию только что разведенного в ДМСО флавоноида, либо только ДМСО (контроль), оба при конечной концентрации ДМСО 0,2%. Были взяты аликвоты для проведения различных окрашиваний жизнеспособности (PI, DHE, AnnexinV / PI), тестов на выживаемость (посев, способность к повторному росту) 13,55 и / или анализов аутофагии (EGFP-Atg8, ALP) в указанные моменты времени ( Инжир.1а).

    Для начального дрожжевого скрининга каждый флавоноид был добавлен в концентрации 50 мкМ. После идентификации DMC как главного цитопротекторного эффекта мы определили оптимальную дозу для лечения дрожжей при 100 мкМ, по крайней мере, в применяемых условиях. Это была самая низкая концентрация, оказывающая наивысший спасительный эффект (дополнительный рис. 2а).

    Одной из основных причин хронологического старения дрожжей может быть чрезмерное производство уксусной кислоты 56 . Соответственно, продолжительность жизни дрожжей можно продлить за счет подщелачивания среды 52 .Следует отметить, что обработка DMC не изменяла pH среды (дополнительный рис. 2f), демонстрируя, что цитопротективные эффекты DMC на хронологическое старение дрожжей не зависят от pH.

    Если не указано иное, показаны репрезентативные эксперименты по старению, по крайней мере, с шестью независимыми биологическими повторностями, выдержанными одновременно. Эксперименты проводились в общей сложности не менее трех раз с аналогичным результатом, за исключением процедуры скрининга, когда каждый флавоноид испытывался в трех-шести независимых образцах для каждого эксперимента по старению.

    Анализы маркеров клеточной смерти в дрожжах

    Для начального дрожжевого скрининга окрашивание PI (некроз) и DHE (образование супероксид-аниона O 2 ) проводили следующим образом: ~ 1 × 10 7 клеток собирали центрифугированием в течение 5 мин при 2700 × г и окрашивали в течение 5 мин йодидом пропидия (100 нг / мл в PBS pH 7,4) или дигидроэтидием (2,5 мкг / мл в PBS pH 7,4) соответственно. Клетки снова осаждали в течение 5 минут при 2700 × г и ресуспендировали в PBS.Относительные единицы флуоресценции определяли с использованием считывающего устройства флуоресценции (Tecan, GeniusPRO) и нормализовали до OD 600 каждого образца. Затем была рассчитана площадь под кривой (AUC) для всех отслеживаемых дней на протяжении хронологического старения и рассчитана оценка Z для результатов с PI и DHE, соответственно. Результаты, полученные в этих высокопроизводительных анализах, положительно коррелируют с соответствующими низкомасштабными экспериментами (дополнительный рис. 1a – c). Следует отметить, что неокрашенный образец из каждой лунки был протестирован в первый день хронологического старения, чтобы учесть возможные собственные флуоресцентные свойства любого данного флавоноида, которые могут мешать нашим анализам на основе флуоресценции.Для анализа жизнеспособности с использованием способности к разрастанию, который ранее использовался для определения жизнеспособности, связанной со старением 41,57 , аликвоты (9 мкл) были взяты на 3-й день хронологического старения для инокуляции 171 мкл свежей среды SCD в 96-луночном корпусе. тарелки. Культуры (всего 180 мкл) выращивали при 28 ° C, 1000 об / мин (скорость двигателя), и OD 600 измеряли в точке инокуляции и через 10 ч после этого с использованием планшет-ридера (Tecan, GeniusPRO). Рост определяли как разницу между измеренной OD 600 во время инокуляции и через 10 часов роста [OD 600 (10 часов) — OD 600 (инокуляция) ], а затем нормализовали для DMSO-обработанного контроль; наконец, была вычислена оценка Z .Как и в других высокопроизводительных анализах (см. Выше), была установлена ​​положительная корреляция между способностью к росту и жизнеспособностью (дополнительный рис. 1b).

    Анализы на апоптоз / некроз (совместное окрашивание аннексином V / PI) после обработки DMC количественно оценивали с помощью проточной цитометрии (BD LSRII Fortessa, BD Biosciences). Вкратце, ~ 1 × 10 7 клеток собирали центрифугированием в течение 5 минут при 2700 × g и промывали один раз водой и один раз буфером B + S (35 мМ калий-фосфатный буфер, pH 6.8, 0,5 мМ MgCl 2 , 1,2 М сорбитол). Для получения сферопластов клетки ресуспендировали в 330 мкл буфера B + S, добавляли 15 мкл глюкуронидазы / арилсульфатазы (Sigma-Aldrich, [BGALA-RO]) и 3 мкл литиказы (1000 U / мл, Sigma-Aldrich [L2524]). , а клетки инкубировали при 28 ° C в течение 30 мин. Сферопласты осаждали при 500 г в течение 2 мин и один раз тщательно промывали буфером В + 0,6 М сорбит. Затем сферопласты ресуспендировали в 30 мкл буфера для инкубации (10 мМ HEPES pH 7,4, 140 мМ NaCl, 5 мМ CaCl 2 ,0.6 M сорбита) и окрашивали в течение 20 минут, добавляя 3 мкл AnnexinV-FLUOS (Sigma-Aldrich [11828681001]) и 3 мкл PI (100 мкг / мл). Для проточной цитометрии с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (BD Biosciences) оценивали в общей сложности 30 000 клеток на образец. Клетки, накапливающие АФК, количественно оценивали путем окрашивания DHE (см. Выше) и последующей проточной цитометрии и анализа 30 000 клеток. Для посева на чашки для клоногенной выживаемости подсчет клеток в культурах, обработанных DMC, и контроле измеряли с использованием счетчика клеток CASY (Schärfe System GmbH), и 500 клеток высевали на чашки с агаром YEPD и инкубировали в течение двух дней при 28 ° C для образования колоний.Колониеобразующие единицы (КОЕ) анализировали с помощью автоматического счетчика колоний (LemnaTech). Для каждого штамма КОЕ, определенные для контрольных культур, были установлены равными 100%, и выживаемость соответствующих культур, обработанных DMC, была рассчитана относительно соответствующей контрольной культуры.

    Конструирование плазмиды и генерация нокаута дрожжей

    Штаммы с одиночными и двойными мутантами были получены в соответствии с описанным методом либо с использованием генно-специфической кассеты с нокаутом URA3, амплифицированной с помощью ПЦР с использованием pUG72 в качестве матрицы 58 или с использованием natNT2 или кассеты hphNT1 pFA6a – natNT2 и pFA6a – hphNT1, соответственно, 53 .Правильность делеции гена проверяли с помощью ПЦР с соответствующими контрольными праймерами и дополнительно проверяли на соответствие ауксотрофии. Все использованные праймеры перечислены в дополнительной таблице 4. Плазмида [pESC-His-6 (HA)] была сконструирована путем расщепления с Sac I / Cla I и лигирования с фрагментом 6 (HA), амплифицированным из pYM17 с использованием праймеров. ClaI_6HA_f и SacI_6HA_r. GLN3 амплифицировали из геномной ДНК из BY4742 с использованием праймеров GLN3_F (NotI) и GLN3_R (ClaI) и клонировали в полученный вектор с использованием сайтов рестрикции Not I / Cla I (см. Дополнительную таблицу 5).Примечательно, что по меньшей мере три разных клона каждого сгенерированного мутанта были протестированы на аналогичный ответ на окрашивание PI во время старения, чтобы исключить клоногенные вариации.

    Измерения аутофагии дрожжей

    Аутофагию исследовали согласно опубликованным методам, определяя либо высвобождение GFP с помощью иммуноблот-анализа (см. Раздел «Иммуноблоттинг»), либо вакуолярную локализацию Atg8 с помощью флуоресцентной микроскопии в клетках, экспрессирующих слитый белок EGFP-Atg8 52 . Кроме того, активность ALP 16 оценивали с использованием соответствующих клеток Pho8ΔN60, трансформированных и отобранных для стабильной вставки фрагмента pTN9 Hind III 59 : ~ 3 × 10 7 клеток собирали центрифугированием при 2700 × g в течение 5 мин и промывали один раз 500 мкл H 2 O.Клетки ресуспендировали в 200 мкл ледяного буфера для анализа (250 мМ Трис / HCl pH 9,0, 10 мМ MgSO 4 , 10 мкМ ZnSO 4 ) и переносили в предварительно охлажденную реакционную пробирку со 100 мкл промытого кислотой стекла. бусы. Клетки разрушали в бисерной мельнице (Mini-Beadbeater) в предварительно охлажденном металлическом штативе для реакционных пробирок в течение 3 × 45 с с 30-секундными интервалами между ними. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 10,000 × g при 4 ° C в течение 10 мин и супернатант осторожно переносили в свежие предварительно охлажденные пробирки.Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка Брэдфорда (Bio-Rad [5000006]). Экстракты клеток, соответствующие 1–1,5 мкг белка, добавляли к конечному объему 550 мкл буфера для анализа (комнатная температура), и реакцию запускали добавлением 50 мкл α-нафтилфосфата (55 мМ в буфере для анализа, pH 9,0). Через 20 мин при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 200 мкл стоп-буфера (2 М глицин / NaOH, pH 11,0). Двести микролитров реакционной смеси измеряли в черных 96-луночных планшетах в устройстве для чтения планшетов (Tecan, GeniusPRO) при ex: 345 нм, em: 472 нм.Для корректировки внутренней (фоновой) активности ЩФ одновременно обрабатывали контрольные культуры (без pTN9) и вычитали активность ЩФ.

    Активность TORC1 дрожжей

    Клетки выращивали до OD 600 0,2 и обрабатывали либо 100 мкМ DMC, либо 40 нМ рапамицином в течение 6 часов. Были собраны три единицы OD 600 и экстрагированы белки (см. Раздел «Иммуноблоттинг»). Фосфорилирование Rps6 по серину 232 и 233 было обнаружено с помощью антитела 60 фосфо-S6 рибосомного белка (Ser235 / 236) (Cell Signaling [# 2211 S], кролик, 1: 1000) и уровни фосфорилирования, нормализованные до GAPDH.В качестве контроля культуры стационарной фазы дикого типа и штаммы rps6aS232A, S233A Δ rps6b (любезный подарок от доктора Тарека Мустафы) были заправлены свежей средой SCD в течение 1 часа перед сбором урожая.

    Активация дрожжевого промотора MEP2

    Зависимая от промотора MEP2 экспрессия lacZ определялась с использованием анализа бета-галактозидазы. В указанные моменты времени собирали 1,5 единицы OD 600 , промывали один раз водой и лизировали в течение 30 с в 380 мкл Z-буфера (100 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 7.0, 10 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4 , 40 мМ 2-мекаптоэтанол) с 50 мкл 0,1% SDS и 50 мкл CHCl 3 с использованием бисерной мельницы (Mini-Beadbeater). После добавления 50 мкл 4 мг / мл о-нитрофенилгалактозида (Serva) суспензии инкубировали при комнатной температуре и останавливали с 125 мкл 1 М Na 2 CO 3 , когда суспензии становились желтыми. Образцы центрифугировали в течение 5 минут при 2700 × g и измеряли поглощение супернатанта при 450 нм. Для оценки доли живых клеток аликвоты культур окрашивали PI и гибель клеток измеряли с помощью проточной цитометрии.Единицы Миллера / живые фракции рассчитывали по формуле [1000x A 450 ] / [объем в мл * OD 600 * время инкубации в мин * фракция PI-отрицательных клеток].

    Определение метаболических изменений дрожжей

    Клетки дрожжей, культивированные в планшетах с глубокими лунками, обрабатывали 100 мкМ DMC (или 0,2% DMSO в качестве контроля) в течение 72 часов. Для каждого повтора 5 мл культуры быстро собирали микрофильтрацией с использованием ПВДФ-фильтров 0,45 мкм, немедленно промывали 10 мл сверхчистой воды, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C перед экстракцией.Экстракцию кипящим этанолом (BE) проводили с помощью 2,5 мл предварительно нагретого буфера BE (75% об. Этанола, 15 мМ ацетат аммония, pH 7,5) в течение 2 минут при 96 ° C на водяной бане с коротким встряхиванием каждые 30 с. После экстракции остатки клеток осаждали центрифугированием в течение 3 минут при 2500 × g при -20 ° C, супернатант концентрировали выпариванием азота и замораживали в сухом виде. Образцы растворяли в 100 мкл LCMS-H 2 O, центрифугировали при 17000 × g в течение 5 минут и супернатант использовали для ЖХ / МС.

    Все образцы были измерены с помощью системы ЖХ / МС от Thermo Fisher ScientificTM. Для разделения соединений перед масс-спектрометрическим детектированием с помощью системы ExactiveTM Orbitrap использовали установку Dionex Ultimate 3000 HPLC, оснащенную аналитической колонкой Atlantis T3 C18 (Waters, США). Для разделения метаболитов использовали метод ВЭЖХ с обращенной фазой с ионной парой (адаптировано из ссылки 61 ). Трибутиламин использовали в качестве ионо-парного агента. Применяли 40-минутный градиент, 2-пропанол и водную фазу (5% метанол (об. / Об.), 10 мМ трибутиламин, 15 мМ уксусная кислота, pH 4.95) использовали в качестве элюента A и B соответственно (дополнительная таблица 6). Объем инъекции составлял 10 мкл на образец, и использовалась инъекционная петля на 20 мкл.

    Отрицательную ионизацию метаболитов проводили с помощью ионизации нагретым электрораспылением (HESI) перед масс-спектрометрическим анализом. Для онлайн-обнаружения аналитов использовали полное сканирование всех масс от 70 до 1100 m / z с разрешением (R) 50 000 (при m / z 200).

    Сбор данных ЖХ / МС проводился с помощью программного обеспечения Xcalibur (версия 2.2 SP1, Thermo Fisher Scientific (Уолтем, США)), исходные данные были преобразованы в mzXML с помощью msConvert (ProteoWizard Toolkit v3.0.5), а метаболиты были подвергнуты целевому поиску с помощью инструмента PeakScout 62 собственной разработки. Чистые аналиты обрабатывали в той же системе для получения точных эталонных времен удерживания и спектров фрагментации. Необработанные данные были дополнительно оценены с помощью Microsoft Excel 2010. Для кластеризации метаболитов площади метаболитов были нормализованы к кумулятивному сигналу всех площадей метаболитов за каждый день (средний сигнал каждого метаболита по всем образцам был установлен на 1) и преобразован log2.Анализ PCA выполняли с использованием инструмента Genesis 1.7.7 (Bioinformatics, Technical University of Graz). Полный набор данных доступен в дополнительном файле данных 1.

    Определение протеома дрожжей с использованием SILAC

    Эксперименты SILAC (мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток) проводили в соответствии с ранее опубликованными протоколами 17 . Вкратце, белки из меченых дрожжевых клеток (Lys0 + Arg0 или Lys4 + Arg10), обработанные 100 мкМ DMC в течение 24 или 72 часов, экстрагировали разрушением стеклянных шариков в буфере P (50 мМ Трис / HCl, pH 7.4, 1% Triton X-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА), содержащий смесь ингибиторов протеаз complete® (Roche), 1 мМ PMSF (Sigma) и ингибиторы HDAC трихостатин А (2 мкМ, Sigma) и никотинамид (30 мМ, Сигма). Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка Bio-Rad (Bio-Rad), и 500 мкг каждого тяжелого и легкого экстрактов смешивали и хранили при -80 ° C перед измерением MS. Для подготовки образцов МС зонды восстанавливали 1 мМ DTT (Sigma-Aldrich) и алкилировали с использованием 5,5 мМ йодацетамида (Sigma-Aldrich).Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и расщепляли в геле с использованием трипсина (Promega) при 37 ° C в течение ночи, и полученные смеси пептидов обрабатывали на наконечниках STAGE 63 .

    Масс-спектрометрические измерения были выполнены на масс-спектрометре LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, Бремен, Германия), соединенном с нанопоточной HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies GmbH, Вальдбронн, Германия). Наконечники колонок для ВЭЖХ (плавленый диоксид кремния) с внутренним диаметром 75 мкм (New Objective, Woburn, MA, USA) были самоупакованы Reprosil-Pur 120 ODS-3 (Dr.Maisch, Ammerbuch, Германия) длиной до 20 см. Образцы наносили непосредственно на колонку без предварительной колонки. Градиент A [0,5% уксусной кислоты (высокая чистота, LGC Promochem, Везель, Германия) в воде (степень градиента для ВЭЖХ, Mallinckrodt Baker BV, Девентер, Нидерланды)] и B [0,5% уксусной кислоты в 80% ACN (LC‐ MS grade, Wako, Germany) в воде] с увеличивающейся органической долей использовали для разделения пептидов (загрузка образца 2% B; линейная скорость разделения: от 10% до 30% B в течение 80 мин). Скорость потока составляла 250 нл / мин, а для нанесения образца — 500 нл / мин.Масс-спектрометр работал в режиме зависимости от данных и автоматически переключался между МС (макс. 1 × 10 6 ионов) и МС / МС. Каждое МС-сканирование сопровождалось максимум пятью МС / МС-сканированиями в линейной ионной ловушке с использованием нормализованной энергии столкновения 35% и целевого значения 5000. Родительские ионы с зарядовым состоянием от z = 1 и неназначенными зарядовыми состояниями были исключен за фрагментацию. Диапазон масс для MS был m / z = 370–2000. Разрешение было установлено на 60 000.Масс-спектрометрические параметры: напряжение распыления 2,3 кВ; отсутствие оболочки и вспомогательного газового потока; температура трубки ионного переноса 125 ° C.

    Файлы исходных данных MS были загружены в программу MaxQuant версии 1.4.1.2 64 , которая выполняет обнаружение пиков, количественную оценку без меток и генерирует списки пиков пептидов с исправленной ошибкой массы, используя следующие параметры: карбамидометилцистеин был установлен как фиксированный модификация, окисление метионина и амино-концевое ацетилирование белка были установлены как вариабельные модификации.Допускались три промаха отщепления, специфичность фермента составляла трипсин / Р, а толерантность МС / МС была установлена ​​на 0,5 Да. Списки пиков были исследованы Andromeda для идентификации пептидов с использованием базы данных Uniprot Saccharomyces cerevisiae , содержащей общие загрязнители, такие как кератины и ферменты, используемые для переваривания в геле. Списки пептидов в дальнейшем использовались MaxQuant для идентификации и относительной количественной оценки белков с использованием следующих параметров: уровни ложного обнаружения пептидов и белков были установлены на 0.01 максимальная апостериорная вероятность ошибки пептида (PEP) была установлена ​​на 1, минимальная длина пептида была установлена ​​на 7, PEP был основан на балле Андромеды, минимальное количество пептидов для идентификации и количественного определения белков было установлено на единицу и должно быть уникальным, и идентифицированные белки были повторно определены количественно.

    Для анализа обогащения использовалось программное обеспечение DAVID Bioinformatics Resources 6.7, NIAID / NIH [https://david-d.ncifcrf.gov/], со следующими настройками: функциональная кластеризация аннотаций (GOTERM_BP_FAT), средняя строгость, подобие Каппа. (перекрытие терминов: 3, порог подобия: 0.5), классификация (начальное членство в группе: 3, окончательное членство в группе: 3, порог множественного связывания: 0,5), порог обогащения (EASE: 1,0). Эталонный протеом был установлен для всех измеренных белков в заданный момент времени. Для расчета значения P использовалась поправка Бенджамини. Полный набор данных доступен в дополнительном файле данных 2.

    Данные масс-спектрометрической протеомики были депонированы в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE 65 с идентификатором набора данных PXD012108 и названием проекта: «Флавоноид 4,4 ‘-Диметоксихалкон способствует зависимому от аутофагии долголетию у разных видов ».

    C. elegans штаммы и обслуживание

    Мы следовали стандартным условиям культивирования нематод 66 . Температуру выращивания нематод поддерживали на уровне 20 ° C, а животных поддерживали при 20 ° C на агаре для выращивания нематод (NGM) с добавлением Escherichia coli (OP50 или трансформированный HT115). Мы использовали штаммы N2 (дикий тип) и Mh5799: elt-1 (ku491) IV для анализа продолжительности жизни и штамм VK1093: vkEx1093 [P nhx-2 :: mCherry :: lgg-1] для измерения аутофагии.

    Анализ продолжительности жизни C. elegans

    DMC-обработка C. elegans осуществлялась на чашках с агаром NGM непрерывно в течение всей жизни, начиная с личинок L1, если не указано иное. Все чашки с агаром получали из одной и той же партии агара NGM и засевали высушенными бактериями (OP50), которые были предварительно убиты УФ-излучением, чтобы избежать вмешательства в метаболизирующую активность ксенобиотиков Escherichia coli . DMC (41.6 мкМ) или эквивалентный объем растворителя ДМСО наносили на высушенные бактерии в планшетах для обработки и контроля, соответственно. Перед использованием планшеты с пятнами сушили в течение ночи при комнатной температуре. Процедуру повторяли каждый раз, когда червей переносили на свежие чашки. В экспериментах на продолжительность жизни РНКи кормление РНКи начиналось на стадии личинки L4. Червей помещали на планшеты с NGM, содержащие 0,5–1 мМ IPTG, и засевали бактериями HT115, трансформированными либо вектором pL4440, либо тестируемой плазмидой РНКи.Бактерии, трансформированные дцРНК, atg-5 (Y71G12B.12), beans-1 (T19E7.3) и elt-1 (W09C2.1) были получены из библиотеки Ahringer C. elegans RNAi 67 . Все бактериальные клоны дцРНК использовали в концентрации 0,9 OD, разведенных пустыми бактериями, несущими вектор, согласно предыдущим исследованиям 68 .

    Анализ выживаемости начинали с момента вылупления, если не указано иное, и проводили при 20 ° C с использованием синхронных популяций 60/80 животных в каждом условии.Животных оценивали как мертвых или живых и переносили каждый день на свежие чашки в течение фертильного периода, а затем через день или каждые 3 дня до смерти. Черви считались мертвыми, когда они перестали глотать кровь и реагировать на прикосновения. Черви, погибшие из-за внутренней мешковины, высыхания из-за ползания по краю пластин или экструзии гонад, оценивались как подвергшиеся цензуре. Эти животные были включены в анализ продолжительности жизни вплоть до цензуры. Обратите внимание, что из-за довольно высокой биологической вариативности, связанной с экспериментами по старению, повторения анализов выживания показаны как отдельные эксперименты; подробности см. в дополнительной таблице 2.

    C. elegans измерения аутофагии

    Для количественной оценки индукции аутофагии использовали штамм VK1093: vkEx1093 [P nhx-2 :: mCherry :: lgg-1]. Черви обрабатывали 41,6 мкМ DMC со стадии L1 в течение 48 часов. Для экспериментов по подавлению червей переносили как L4 на соответствующие планшеты (контроль и соответствующие РНКи ± DMC). Через 24 часа молчания (взрослых) червей регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа.

    Используя ImageJ, [http: // imagej.nih.gov/ij/], изображенные черви были выбраны вручную и подсчитано количество очагов с использованием автоматизированной функции ImageJ «Анализ частиц» на скорректированных изображениях. Чтобы избежать артефактов, все изображения были получены и настроены с использованием одних и тех же настроек.

    D. melanogaster штаммы и среды

    Мы использовали Drosophila melanogaster w 1118 или Atg7 — / — мух. Последние были получены путем скрещивания девственниц Atg7 d77 / + с самцами Atg7 d14 / + 69 , оба изогенизированных до w 1118 .Эксперименты с мухами проводились с использованием двух разных сред: (i) CSY, содержащая 1% агара (BD), 1% дрожжевого экстракта Bacto ™ (BD), 5% сахарозы (Roth), 0,8% кукурузной муки, 0,03% (об. / Об.) Пропионовой кислоты. кислоты и 0,3% (об. / об.) раствора 4-гидроксибензоата (Sigma-Aldrich, 100 г / л в 100% этаноле) или (ii) кукурузно-мелассовая среда Bloomington, содержащая 0,8% агара, 0,75% сухих пекарских дрожжей, 0,83 % соевого шрота, 8,5% сиропа сахарной свеклы, 6,7% кукурузной муки, 0,0525% (об. / об.) пропионовой кислоты и 0,42% раствора 4-гидроксибензоата (310 г / л в 100% этаноле).Для обеих сред добавляли пропионовую кислоту и 4-гидроксибензоат, когда пища остыла до 60 ° C. DMC добавляли при 40 ° C до конечной концентрации 200 мкМ и концентрации DMSO 0,1%. Пищу хранили при 4 ° C не более 1 недели.

    D. melanogaster анализ продолжительности жизни

    Мух выращивали в стандартных широких пластиковых флаконах с пробками и вылупляли в течение трех дней, пока их не собирали, давали возможность спариваться в течение 24 часов, а затем распределяли по полу под анестезией CO 2 и сортировали на порции по 20 штук. мухи с максимальным общим временем анестезии 6 мин.Для иммунофлуоресценции мозга мух анестезировали не более 2 мин. На CSY мух переводили на свежий корм три раза в неделю, на среду кукурузной муки и патоки Bloomington — через день. Случайно сбежавшие мухи подвергались цензуре. Все эксперименты по старению проводились в климатических камерах при 25 ° C и влажности 70% с циклом 12 часов / 12 часов свет / темнота. Обратите внимание, что из-за довольно высокой биологической вариативности, связанной с экспериментами по старению, повторения анализов выживания показаны как отдельные эксперименты; подробности см. в дополнительной таблице 2.

    Анализ потребления корма для мух

    Кормление определялось с помощью тестов капиллярного питания. Вкратце, пластиковые флаконы для мух наполняли 3 мл 1% агара и в стенку флакона с помощью горячего шприца вводили три небольших отверстия для воздуха. Флаконы закрывали парафильмом (Bemis NA) и резиновыми крышками, содержащими два дополнительных отверстия для вентиляции и два отверстия для стеклянных капилляров на 5 мкл (Hirschmann). Четыре самки мух на флакон приучали к процедуре кормления в течение 2 дней. Затем кормление тестовым кормом (2.5% дрожжевой экстракт, 2,5% сахарозы и 200 мкМ DMC или соответствующее количество DMSO) отслеживали в течение трех последовательных 10-15-часовых интервалов. Были проанализированы пять независимых флаконов для каждого условия, и поведение при кормлении выражалось как мкл корма * муха -1 * 12 ч -1 .

    Анализ плодовитости мух

    Мух (возрастом от 1 до 4 дней) переносили в новые флаконы и позволяли спариваться в течение 48 часов перед их сортировкой на порции по 10 самок животных под наркозом CO 2 . Мух выдерживали на корме Bloomington, содержащем 200 мкМ DMC, или на контрольном корме.В указанные моменты времени мух переводили на свежий корм на 16 ч, а затем подсчитывали личинок и яиц первого возраста. Всего было проанализировано шесть независимых флаконов для каждого условия.

    Измерения аутофагии мух

    w 1118 мух выращивали на среде кукурузной муки и патоки Bloomington, содержащей 0,47% агара, 0,75% сухих пекарских дрожжей, 0,83% соевого шрота, 8,5% сиропа сахарной свеклы, 6,7% кукурузной муки, 0,0525% (об. / об.) пропионовой кислоты и 0,42% раствора 4-гидроксибензоата (310 г / л в 100% этаноле) и оставляют для вылупления в течение 2 дней.Затем мух переносили в новые флаконы и давали спариваться на 24 часа. Порции 20 самок мух были отсортированы под наркозом CO 2 с максимальной анестезией 2 мин и перенесены в небольшие флаконы, содержащие контрольный корм (0,1% ДМСО) или корм с добавлением 200 мкМ DMC, оба из которых содержат 1% агара. Мух переносили в свежие флаконы через день и выдерживали в течение 3 (молодые) или 30 дней (старые) при 25 ° C и влажности 70% с циклом 12 часов / 12 часов свет / темнота.

    Мозги 30-дневных самок мух препарировали и собирали в ледяном гемолимфоподобном физиологическом растворе (HL-3).После фиксации в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,7% тритона X-100 (PBS-T) и 4% параформальдегида, в течение 30 минут и нескольких стадий промывки в PBS-T, сайты связывания неспецифических антител блокировали 10% нормальной козьей сывороткой. Мозг инкубировали с поликлональным антителом против Ref (2) P (кролик, подарок доктора Габора Юхаса, 1: 8000) в течение 48 часов, промывали шесть раз, а затем инкубировали с соответствующим вторичным антителом, связанным с Alexa 488 (кролик , Invitrogen, [# A11034], 1: 500) еще на 16 часов.11-12 мозгов каждого состояния хранили в VectaShield (Vector Laboratories LTD., Питерборо, Соединенное Королевство) в чашках Петри со стеклянным дном при 4 ° C и сканировали с помощью конфокальной микроскопии в течение 2-4 недель.

    Данные пространственного изображения были получены с использованием конфокального микроскопа Leica SP5 со спектральным детектированием (Leica Microsystems, Inc.) и иммерсионного объектива HCX IRAPO L 25x / 0.95 NA . Z-стеки были получены с использованием резонансного сканера (8000 Гц, усреднение по 8 строкам, 1024 × 1024 пикселей).Флуоресценцию Alexa 488 возбуждали на длине волны 488 нм, а эмиссию детектировали на длине волны 500–550 нм. Шум изображения был уменьшен деконволюцией изображения (Huygens Pro, SVI B.V .; оптимизированный подход оценки максимального правдоподобия; пять итераций). Обработанные z-стеки проецировались с использованием метода проекции максимальной интенсивности. Анализ изображений проекций проводился с использованием программного обеспечения ImageJ, [http://rsbweb.nih.gov/ij/]. Центральная область мозга, состоящая из 11–12 мозгов на одно состояние, была выбрана вручную с помощью инструмента «Свободная рука» и измерено среднее значение серого, относящееся к выбранной области каждого мозга.

    Условия культивирования клеток и линии клеток

    Питательные среды и добавки для культивирования клеток были приобретены у Gibco-Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США), а пластиковая посуда у Corning (Корнинг, Нью-Йорк, США). Клетки U2OS остеосаркомы человека (линия клеток была приобретена у ATCC [HTB-96]) и их производные, экспрессирующие GFP-LC3, культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мг / л пирувата натрия, 10 мМ буфер HEPES, 100 ед / мл пенициллина G натрия и 100 мкг / мл сульфата стрептомицина (37 ° C, 5% CO 2 ).Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 (линия клеток была приобретена у ATCC [HB8065]) культивировали в среде EMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 мг / л пирувата натрия, 10 мМ буфера HEPES, 100 единиц / мл пенициллина G натрия и 100 единиц / мл пенициллина G натрия. мкг / мл сульфата стрептомицина. Клетки колоректального рака человека HCT116 (линия клеток была приобретена в ATCC [CCL-247]) культивировали в среде МакКоя, обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой, 100 мг / л пирувата натрия, 10 мМ буфера HEPES, 100 единиц / мл пенициллина G натрия. и 100 мкг / мл сульфата стрептомицина.Для индукции аутофагии клетки обрабатывали в течение 8 часов 50 мкМ DMC (Sigma Aldrich [S617237]) в присутствии или в отсутствие 50 мкМ хлорохина (Sigma Aldrich [C6628]) для правильной оценки аутофагического потока.

    Измерения аутофагии клеточных культур с помощью автоматической микроскопии

    GFP-LC3 Клетки U2OS были получены трансфекцией клеток U2OS плазмидой pEGFP-LC3 и поддерживались селекцией с помощью неомицина. Клетки GFP-LC3 HCT116 получали трансфекцией лентивирусной конструкцией GFP-LC3 (Millipore [17-10193]).Клетки U2OS или HCT116, стабильно экспрессирующие GFP-LC3, высевали в 96-луночные или 384-луночные планшеты для получения изображений (Greiner) за 24 ч до стимуляции. Клетки обрабатывали DMC в течение 8 ч в присутствии или в отсутствие хлорохина (в течение 2 ч до фиксации). Затем клетки фиксировали 4% PFA и окрашивали 10 мкМ Hoechst 33342. Изображения получали с помощью автоматического микроскопа BD pathway 855 (BD Imageing Systems, Сан-Хосе, США), оснащенного объективом 40X (Olympus, Center Valley, США). в сочетании с роботизированным манипулятором планшетов Twister II (Caliper Life Sciences, Хопкинтон, США).Изображения анализировали на наличие точек GFP-LC3 в цитоплазме с помощью программного обеспечения BD Attovision (BD Imageing Systems). Поверхности клеток были сегментированы и разделены на цитоплазматические и ядерные области в соответствии со стандартными процедурами производителя. Алгоритмы RB 2×2 и Marr – Hildreth были использованы для распознавания цитоплазматических GFP-LC3 положительных точек. Для анализа siRNA клетки U2OS, стабильно экспрессирующие GFP-LC3, трансфицировали scramble siRNA (siCtr) или siRNA, нацеленными на GATA1 (siGATA1), GATA2 (siGATA2), GATA3 (siGATA3), GATA4 (siGATA4), GATA6GATA5 (siGATA4), GATA6GATA5 (siGATA4), GATA6GATA5 (siGATA4), GATA6GATA5 ), TRPS1 (siTRPS1) и Atg5 (siAtg5) (3 отдельные последовательности миРНК на каждый ген, см. Таблицу 5) в течение 48 часов, затем 50 мкМ DMC (или 10 мкМ рапамицина) или выдерживают в контрольных условиях еще 6 часов.После этого клетки фиксировали и измеряли аутофагию, как описано выше. Для количественной оценки были рассчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего по данным всех трех отдельных последовательностей миРНК. Эффективность нокдауна была подтверждена вестерн-блоттингом (дополнительная фигура 13).

    Дрожжевой анализ хронологического старения

    Анализ выполняли, как описано в Леонтьевой и др. 70 . Вкратце, 80 000 клеток высевали в 96-луночные планшеты и оставляли без обработки или обработки 50 мкМ DMC.Через 5 дней мертвые клетки и кондиционирующую среду удаляли, клетки обрабатывали трипсином и 10% аликвоту помещали в заполненные свежей средой шестилуночные планшеты. Через 1 неделю клоны помечали путем окрашивания кристаллическим фиолетовым и подсчитывали.

    Определение фосфорилирования S6K1

    Клетки U20S обрабатывали в течение 6 часов двумя разными дозами DMC или рапамицина (1 мкМ). Активность mTORC1 оценивали с помощью иммуноблоттинга и оценивали как уровни фосфорилирования его целевого рибосомного протеина S6 киназы бета-1 (S6K1 / P70S6K1) на треонин 389 с использованием фосфо-специфических антител (Cell Signaling Technology, [# 9205]).Рапамицин использовали в качестве положительного контроля ингибирования mTORC1.

    Проверка и извлечение растений

    Angelica keiskei koidzumi растения были приобретены у местного продавца. Растения имели морфологические характеристики вида, включая перистые листья, пильчатые, трехраздельные листочки, длинные черешки с опушением и характерную окраску сока. Кроме того, ДНК растений, экстрагированная из быстро замороженных листьев, была проверена генотипически. Следовательно, ядерная рДНК (внутренний транскрибируемый спейсер 1, 5.Ген рибосомной РНК 8S и внутренний транскрибируемый спейсер 2) амплифицировали с праймерами ITS4 и ITS5 (дополнительная таблица 5), и продукт секвенировали с использованием тех же праймеров (MWG Biotech, Ebersberg, Germany). Сравнение с регистрационным номером GenBank. GU395158.1 подтвердил генотип Angelica keiskei koidzumi .

    Для обнаружения DMC в Angelica keiskei koidzumi , свежий растительный материал (~ 2 г корней и ножек / листьев соответственно) был собран, разрезан на кусочки 5 × 5 мм, мгновенно заморожен и измельчен предварительно охлажденной сталью. бисер в бисерной мельнице (mini-beadbeater, Biospec Products).Растительный порошок замораживали в сухом виде и хранили при -80 ° C в течение не менее 24 часов перед экстракцией (процедуру экстракции см. В разделе «Экстракции и измерения DMC»).

    Содержание мышей и подготовка сыворотки

    Самцы мышей C57BL / 6 были приобретены в Janvier Labs, Франция. Лечение животных начали в возрасте 12 месяцев. Всех мышей содержали и лечили в соответствии с национальными и европейскими этическими нормами (Директива 2010/63 / ЕС) и экспериментами, одобренными ответственным государственным учреждением (Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, BMWFW, Австрия).Мышей кормили ad libitum обычным кормом (гранулы, Ssniff, Германия) с добавлением 0,25% DMC в течение 7 дней. Физическая активность животных, осмотр, дефекация, потребление пищи и воды, а также масса тела тщательно контролировались для обеспечения нормального поведения. В конце эксперимента животных анестезировали ингаляцией изофлурана и умерщвляли. Плазму получали центрифугированием при 200 × g в течение 10 мин при 4 ° C и выдерживали при -80 ° C перед экстракцией.

    Для измерения аутофагии у мышей использовали самцов мышей C57BL / 6 в возрасте 6 недель или Atg4b — / — мышей (Harlan, Франция).Эксперименты на животных проводились в соответствии с Директивой ЕС 63/2010 и протоколом APAFIS № 10511-2017070511526660 v2, одобренным Этическим комитетом CRC (CEEA № 5, зарегистрированный в Министерстве исследований Франции). Atg4b — / — мыши были любезно предоставлены доктором Карлосом Лопес-Отином (Университет Овьедо, Испания).

    Мышей содержали в среде с контролируемой температурой с 12-часовыми циклами свет / темнота и давали пищу и воду ad libitum. Мышам внутрибрюшинно вводили однократную дозу DMC 100 мг / кг, растворенную в 50 мкл ДМСО и 30 мг / кг лейпептина (за 2 часа до умерщвления), а через 6 часов их умерщвляли.Ткани мгновенно замораживали в жидком азоте и гомогенизировали (два цикла по 20 с при 5500 об / мин [скорость двигателя]) с использованием тканевого гомогенатора Precellys 24 (Bertin Technologies, Монтиньи-ле-Бретонне, Франция) в 20 мМ Трис-буфере (pH 7,4). ), содержащий 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 10 мМ ЭДТА и коктейль ингибиторов протеазы Complete® (Roche Applied Science, Пенцберг, Германия). Затем тканевые экстракты центрифугировали при 12000 × g при 4 ° C и собирали супернатанты. Концентрацию белка в супернатантах оценивали методом бицинхониновой кислоты (набор для анализа белка BCA, Pierce Biotechnology, Rockford, США).

    Для пролонгированной ишемии in vivo из лаборатории Джексона были получены трехмесячные самцы мышей C57BL / 6J дикого типа или Atg7 с кардиоспецифическим нокаутом (Atg7cKO). Всех мышей содержали и лечили в соответствии с национальными этическими правилами (протокол IACUC №17022) и экспериментами, одобренными ответственным учреждением (Комитет по уходу и использованию животных Медицинской школы Рутгерса-Нью-Джерси). Мышей содержали в среде с контролируемой температурой с 12-часовыми циклами свет / темнота, где они получали пищу и воду ad libitum.Трехмесячных мышей C57BL / 6 J анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала натрия (60 мг / кг). Был использован вентилятор для грызунов (Minivent; Harvard Apparatus Inc.) с 65% кислородом. Животных держали в тепле с помощью тепловых ламп. Ректальную температуру контролировали и поддерживали в пределах от 36,8 до 37,2 ° C. Грудная клетка была вскрыта горизонтальным разрезом в четвертом межреберье. Ишемия была достигнута путем перевязки передней нисходящей ветви левой коронарной артерии (ПНА) с использованием проленового шва 8-0 на 2 мм ниже границы между левым предсердием и ЛЖ.Ишемию подтверждали изменением ЭКГ (подъем сегмента ST) и изменением цвета миокарда. После выхода из наркоза мышей возвращали в клетки. Они были размещены в среде с контролируемым климатом.

    Определение метаболических изменений в сердце и печени мышей

    Животных обрабатывали, как описано для измерения аутофагии у мышей (см. Раздел «Содержание мышей и подготовка сыворотки»). Все используемые стандартные и реактивные вещества были получены от Sigma-Aldrich, за исключением карбоната аммония (VWR).Для подготовки образцов ткани печени и сердца около 30 мг тканей для каждого состояния сначала взвешивали и солюбилизировали в 1,5 мл полипропиленовых микроцентрифужных пробирках с керамическими шариками с 1 мл холодного лизатного буфера (MeOH / вода / хлороформ, 9/1/1. , −20 ° С). Затем их гомогенизировали трижды в течение 20 с при 5500 об / мин (скорость двигателя) с использованием гомогенизатора тканей Precellys 24 (Bertin Technologies, Монтиньи-ле-Бретонне, Франция) с последующим центрифугированием (10 мин при 15000 × g , 4 ° C).Затем верхняя фаза супернатанта была разделена на две части: первые 270 мкл использовали для газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ / МС) в центрифугировании микропробирок, остальные 250 мкл использовали для жидкостной хроматографии сверхвысокого давления в сочетании с масс-спектрометрией. Спектрометрические (УВЭЖХ / МС) эксперименты.

    Что касается аликвот ГХ-МС, 150 мкл были перенесены из центрифугированной микропробирки в стеклянную пробирку и выпарились. К высушенным экстрактам добавляли 50 мкл метоксиамина (20 мг / мл в пиридине), затем хранили при комнатной температуре в темноте в течение 16 часов.На следующий день добавляли 80 мкл MSTFA, и конечная дериватизация происходила при 40 ° C в течение 30 минут. Затем образцы были перенесены во флаконы и непосредственно введены в ГХ-МС.

    Что касается аликвот ЖХ-МС, собранный супернатант выпаривали в микроцентрифужных пробирках при 40 ° C в концентраторе с пневматическим приводом (Techne DB3, Staffordshire, UK ). Высушенные экстракты ЖХ-МС солюбилизировали 450 мкл воды MilliQ и аликвотировали в трех микроцентрифужных пробирках (100 мкл) для каждого метода ЖХ и в одной микроцентрифужной пробирке для безопасности.

    Аликвоты для анализа переносили во флаконы для ЖХ и вводили в ЖХ / МС или хранили при -80 ° C до инъекции.

    Для пробоподготовки полиаминов (печень, сердце) около 30 мг тканей для каждого состояния сначала взвешивали и солюбилизировали в полипропиленовых микроцентрифужных пробирках на 1,5 мл с 1 мл холодного лизатного буфера с 1% сульфосалициловой кислотой (MeOH / вода 1). % SSA, 9/1, -20 ° С). Затем их гомогенизировали трижды в течение 20 с при 5500 об / мин (скорость двигателя) с использованием гомогенизатора тканей Precellys 24 (Bertin Technologies, Монтиньи-ле-Бретонне, Франция) с последующим центрифугированием (10 мин при 15000 g, 4 ° C).Шестьсот микролитров верхней фазы супернатанта собирали и упаривали в микроцентрифужных пробирках при 40 ° C в концентраторе с пневматическим приводом (Techne DB3, Стаффордшир, Великобритания). Высушенные экстракты ЖХ-МС солюбилизировали в 300 мкл воды MilliQ, центрифугировали (10 мин при 15000 × g , 4 ° C) и 50 мкл переносили в полипропиленовый флакон для инъекций для метода ЖХ, а остальное переносили в микроцентрифугу. трубка для безопасности. Аликвоты, перенесенные в полипропиленовые флаконы, вводили в ЖХ / МС или хранили при -80 ° C до инъекции.

    Был проведен ряд целевых и нецелевых анализов, чтобы получить полную картину метаболического воздействия DMC. Обратите внимание, что все переходы MRM для перечисленных ниже методов доступны по запросу.

    (1) Целевой анализ CoA и нуклеозид-фосфатов с помощью ионно-парной сверхвысокопроизводительной жидкостной хроматографии (УВЭЖХ) в сочетании с тройным квадрупольным (QQQ) масс-спектрометром был выполнен на системе RRLC 1260 (Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия), подключенной на тройной квадруполь 6410 (Agilent Technologies), оборудованный источником электроспрея, работающим в положительном режиме.Температуру газа устанавливали на 350 ° C с расходом газа 12 л / мин. Напряжение на капилляре было установлено 3,5 кВ. 10 мкл образца вводили в колонку XDB-C18 (размер частиц 100 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм) от Agilent Technologies, защищенную защитной колонкой XDB-C18 (размер частиц 5 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм) и нагревали при 40 ° C. ° C с помощью печи для пеллетье. Нагрев колонки больше комнатной температуры позволил строго контролировать температуру колонки. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 2 мМ DBAA (A) и ацетонитрила (B).Скорость потока была установлена ​​равной 0,2 мл / мин, а градиент был следующим: начальное состояние составляло 90% фазы A и 10% фазы B, поддерживалось в течение 4 минут. Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 10% до 95% фазы B в течение 3 минут. Колонку промывали 95% мобильной фазой B в течение 3 минут и уравновешивали 10% мобильной фазой B в течение 3 минут. Автосэмплер поддерживали при 4 ° C. В конце серии анализа колонку промывали 0,3 мл / мин водой MilliQ (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10% фазы B в течение 20 минут, до 90% фазы B за 20 минут, и выдерживается в течение 20 мин до отключения.Столкновительный газ — азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов. Обнаружение пиков и интеграцию 23 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

    (2) Широко направленный анализ внутриклеточных метаболитов с помощью газовой хроматографии (ГХ), сопряженной с тройным квадрупольным (QQQ) масс-спектрометром, выполнялся на газовой хроматографии 7890 A (Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия), сопряженной с тройным квадруполем 7000 ° C. (Agilent Technologies, Вальдбронн, Германия) с высокочувствительным электронным источником удара (ЭУ), работающим в положительном режиме.Температура переднего входа составляла 250 ° C, закачка производилась в режиме без деления потока. Температура линии передачи и источника ионов составляла 250 ° C и 230 ° C соответственно. Поток продувки перегородки был установлен на уровне 3 мл / мин, поток продувки для разделения вентиляции работал со скоростью 80 мл / мин в течение 1 мин, а режим экономии газа был установлен на 15 мл / мин через 5 мин. Газообразный гелий протекал через колонку (J&WScientificHP-5MS, 30 м × 0,25 мм, внутренний диаметр 0,25 мм, d.f., Agilent Technologies Inc.) со скоростью 1 мл / мин. Температуру колонки поддерживали на уровне 60 ° C в течение 1 мин, затем повышали до 210 ° C (10 ° C / мин), с последующим шагом до 230 ° C (5 ° C / мин) и достигали 325 ° C (15 ° C). / мин) и выдерживают при этой температуре 5 мин.Столкновительный газ — азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов. Обнаружение пиков и интеграцию 133 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

    (3) Целевой анализ полиаминов с помощью ионной пары УВЭЖХ в сочетании с тройным квадрупольным (QQQ) масс-спектрометром выполнялся на системе RRLC 1260 (Agilent Technologies, Waldbronn, Германия), связанной с тройным квадруполем 6410 (Agilent Technologies), оснащенной источник электрораспыления, работающий в положительном режиме.Температуру газа устанавливали на 350 ° C с расходом газа 12 л / мин. Напряжение на капилляре было установлено 3,5 кВ. 10 мкл образца вводили в колонку Kinetex C18 (150 мм × 2,1 мм, размер частиц 2,6 мкм) от Phenomenex, защищенную защитной колонкой C18 (5 мм × 2,1 мм) и нагревали до 40 ° C с помощью печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 0,1% HFBA (A) и ацетонитрила с 0,1% свежеприготовленной HFBA (B). Скорость потока была установлена ​​равной 0,2 мл / мин, а градиент был следующим: исходное состояние составляло 95% фазы A и 5% фазы B.Затем молекулы элюировали с использованием градиента фазы В от 5% до 40% в течение 10 мин. Колонку промывали 90% подвижной фазы В в течение 2,5 мин и уравновешивали 5% подвижной фазой В в течение 4 мин. Автосэмплер поддерживали при 4 ° C. В конце серии анализа колонку промывали 0,3 мл / мин водой MilliQ (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10% фазы B в течение 20 минут, до 90% фазы B за 20 минут, и выдерживается в течение 20 мин до отключения. Столкновительный газ — азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов.Обнаружение пиков и интеграцию 14 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

    (4) Целевой анализ желчных кислот с помощью ионной пары УВЭЖХ в сочетании с тройным квадрупольным (QQQ) масс-спектрометром выполнялся на системе RRLC 1260 (Agilent Technologies, Waldbronn, Германия), соединенной с тройным квадруполем 6410 (Agilent Technologies), оснащенной с источником электрораспыления, работающим в положительном режиме. Температуру газа устанавливали на 325 ° C с расходом газа 12 л / мин.Напряжение на капилляре было установлено равным 4,5 кВ. 10 мкл образца вводили в колонку Poroshell 120 EC-C8 (размер частиц 100 мм × 2,1 мм, 2,7 мкм) от Agilent Technologies, защищенную защитной колонкой XDB-C18 (размер частиц 5 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм) и нагревали. при 40 ° C с помощью печи-пеллете. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 0,2% муравьиной кислоты (A) и свежеприготовленного ацетонитрила / изопропанола (1/1; об. / Об.) (B). Скорость потока была установлена ​​на 0,3 мл / мин, а градиент был следующим: начальное состояние составляло 70% фазы A и 30% фазы B, поддерживалось в течение 1.5 мин. Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 30% до 60% фазы B в течение 9 минут. Колонку промывали 98% подвижной фазы В в течение 2 мин и уравновешивали 30% подвижной фазой В в течение 2 мин. После каждой инъекции иглу дважды промывали изопропанолом и трижды водой. Автосэмплер поддерживали при 4 ° C. В конце серии анализа колонку промывали 0,3 мл / мин водой MilliQ (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10% фазы B в течение 20 минут, до 90% фазы B за 20 минут, и выдерживается в течение 20 мин до отключения.Столкновительный газ — азот. Используемый режим сканирования представлял собой MRM для биологических образцов. Обнаружение пиков и интеграцию 28 аналитов выполняли с использованием количественного программного обеспечения Agilent Mass Hunter (B.07.01).

    (5) Ненаправленный анализ внутриклеточных метаболитов с помощью УВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром Q-Exactive с использованием метода обращенно-фазового ацетонитрила был выполнен на системе УВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific) в сочетании с Q-Exactive (Thermo Scientific). ) оснащен источником электрораспыления, работающим как в положительном, так и в отрицательном режиме и в режиме полного сканирования от 100 до 1200 m / z .Параметры Q-Exactive: скорость потока газа через оболочку 50 а.е., скорость потока вспомогательного газа 10 а.е., напряжение распыления 4 кВ, температура капилляра 300 ° C, уровень S-Lens RF 55 В. 10 мкл образца вводили в SB- Колонка Aq (100 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) от Agilent Technologies, защищенная защитной колонкой XDB-C18 (5 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) и нагретая до 40 ° C с помощью печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 0,2% уксусной кислоты (A) и ацетонитрила (B). Скорость потока была установлена ​​на 0.5 мл / мин. Исходные условия: 98% фазы A и 2% фазы B. Затем молекулы элюировали с использованием градиента от 2% до 95% фазы B за 8 мин. Колонку промывали 95% подвижной фазой B в течение 3 минут и уравновешивали, используя 2% подвижную фазу B в течение 3 минут. Автосэмплер поддерживали при 4 ° C. В конце серии анализа колонку промывали 0,4 мл / мин водой MilliQ (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10% фазы B в течение 20 минут, до 90% фазы B за 20 минут, и выдерживается в течение 20 мин до отключения.Обнаружение пиков и интегрирование проводили с использованием количественного программного обеспечения Thermo Xcalibur (3.1.).

    (6) Ненаправленный анализ внутриклеточных метаболитов с помощью УВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром Q-Exactive с использованием метода обращенно-фазового метанола был выполнен на системе УВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific), соединенной с Q-Exactive (Thermo Scientific) оснащен источником электрораспыления, работающим как в положительном, так и в отрицательном режиме и в режиме полного сканирования от 66 до 990 m / z .Параметры Q-Exactive были следующими: расход газа через оболочку 50 а.е., расход вспомогательного газа 10 а.е., напряжение распыления 4 кВ, температура капилляра 300 ° C, уровень S-Lens RF 55 В. Десять микролитров образца вводили в Eclipse Plus. колонка (100 мм × 2,1 мм, размер частиц 1,8 мкм) от Agilent Technologies, защищенная защитной колонкой XDB-C18 (размер частиц 5 мм × 2,1 мм, 1,8 мкм) и нагретая до 40 ° C с помощью печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 0,05% муравьиной кислоты (A) и метанола с 0.05% муравьиной кислоты (B). Скорость потока была установлена ​​на 0,35 мл / мин. Исходное состояние было 95% фазы A и 5% фазы B в течение 4 минут. Затем молекулы элюировали с использованием градиента фазы В от 5% до 60% за 13 мин. Затем колонку промывали 90% подвижной фазы В в течение 2,5 мин и уравновешивали 5% подвижной фазой В в течение 7,5 мин. Автосэмплер поддерживали при 4 ° C. В конце серии анализа колонку промывали 0,4 мл / мин водой MilliQ (фаза A) и ацетонитрилом (фаза B) следующим образом: 10% фазы B в течение 20 минут, до 90% фазы B за 20 минут, и выдерживается в течение 20 мин до отключения.Обнаружение пиков и интегрирование проводили с использованием количественного программного обеспечения Thermo Xcalibur (3.1.).

    (7) Ненаправленный анализ внутриклеточных метаболитов с помощью УВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром Q-Exactive с использованием метода HILIC был выполнен на системе УВЭЖХ Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientific), соединенной с Q-Exactive (Thermo Scientific), оснащенным источник электрораспыления, работающий как в положительном, так и в отрицательном режиме и в режиме полного сканирования от 66 до 990 m / z. Параметры Q-Exactive: расход газа через оболочку 50 а.е., расход вспомогательного газа 10 а.е., напряжение распыления 4 кВ, температура капилляра 300 ° C, уровень S-Lens RF 55 В.Образец разбавляли конечным объемом 50% ацетонитрила, затем 5 мкл вводили в SeQuant ZIC-pHILIC (150 мм × 2,1 мм размер частиц 5 мкм) от Merck Millipore, защищенный защитной колонкой SeQuant ZIC-pHILIC (20 мм × 2,1 мм, размер частиц 5 мкм) и нагревали при 40 ° C в печи для гранулирования. Градиентная подвижная фаза состояла из воды с 20 мМ карбоната аммония (A) и ацетонитрила (B). Скорость потока была установлена ​​на 0,3 мл / мин. Исходное состояние составляло 5% фазы A и 95% фазы B в течение 1 мин. Затем молекулы элюировали с использованием следующего градиента: 92% за 2 мин, 86.5% за 0,5 мин, 65% за 17,5 мин подвижной фазы B. Колонку промывали, используя 10% подвижную фазу B в течение 4,5 минут, а затем уравновешивали для следующего анализа, используя 95% подвижную фазу B в течение 9 минут. Автосэмплер поддерживали при 4 ° C. В конце серии анализа колонку промывали 0,3 мл / мин воды, 5 мМ ацетата аммония (фаза A) и ацетонитрила (фаза B) следующим образом: 50% фазы B в течение 21 мин, до 80% фазы B в 21 мин, выдерживается в течение 18 мин до отключения. Для удаления остаточных солей из трубок была добавлена ​​дополнительная промывка автоматического пробоотборника (вода / ацетонитрил; 9/1; об. / Об.) В течение 15 мин при отключенной колонке.Обнаружение пиков и интегрирование проводили с использованием количественного программного обеспечения Thermo Xcalibur (3.1.). Полный набор данных доступен в файлах дополнительных данных 3 и 4.

    Кластеризация метаболитов

    Иерархическая кластеризация была выполнена с использованием пакета MetaboAnalyst 3.0 71 с нормализованными данными log2 в качестве входных данных с использованием следующих параметров (если не указано иное): отсутствует оценка стоимости: пропущено; нормализация данных: нет; преобразование данных: нет; масштабирование данных: нет; мера расстояния: Пирсон; алгоритм кластеризации: Уорд; цветовой контраст по умолчанию; топ-50 метаболитов, ранжированных по тестам; стандартизация данных: функции автомасштабирования.Комбинированная топология путей и анализ обогащения были выполнены с использованием инструмента анализа путей MetaboAnalyst 3.0 со следующими параметрами: оценка пропущенного значения: пропущено; нормализация данных: нет; преобразование данных: нет; масштабирование данных: нет; анализ обогащения путей: глобальный тест; анализ топологии пути: центральность относительной промежуточности; ссылка: все соединения выбранных путей. Дорожки с ударом «0» не показаны. Поскольку гексозофосфат нельзя однозначно отнести к конкретному метаболиту, он был исключен из анализа топологии пути дрожжей.Полный анализ топологии пути доступен в дополнительном файле данных 1 (дрожжи), дополнительном файле данных 3 (сердце мыши) и дополнительном файле данных 4 (печень мыши).

    Измерение размера инфаркта

    Через три часа после перевязки ПМЖВ животных анестезировали, интубировали и открывали грудную клетку. Чтобы разграничить ишемическую зону риска (AAR), краситель Alcian blue (1%) перфузировали в аорту и коронарные артерии. Сердца были вырезаны, и LV были разрезаны на поперечные срезы толщиной 1 мм.Затем срезы сердца инкубировали с 1% раствором хлорида трифенилтетразолия при 37 ° C в течение 15 мин. Площадь инфаркта (белый), AAR (не синий) и общая площадь LV с обеих сторон каждого участка были измерены с помощью программного обеспечения ImageJ, а полученные значения были усреднены. Процент площади инфаркта и AAR каждого раздела умножали на вес раздела, а затем суммировали по всем разделам. AAR / LV и площадь инфаркта / AAR были выражены в процентах.

    Отравление этанолом и определение активности ALT

    Мышей не кормили в течение 6 часов, а затем им вводили 33% (об. / Об.) Раствор этанола в общей совокупной дозе 4.5 г / кг через четыре поровну разделенных зонда с 20-минутными интервалами, как описано в Ding et al. 72 . Контрольным мышам вводили такой же объем воды. Носитель (ДМСО) или ДМС вводили мышам внутрибрюшинно за 30 мин до введения этанола. Сбор крови под нижней челюстью производился через 16 ч после приема этанола. Повреждение печени количественно определяли как активность ALT в сыворотке (активность аланинаминотрансферазы) с помощью специального набора (набор для анализа активности аланинтрансаминазы, Abcam [ab105134]). Активность ALT рассчитывали как [мЕ * мг -1 ] пирувата, полученного в реакции.

    Экстракции и измерения DMC

    Для экстракции образцов растений DMC 10 мг растительного порошка помещали в 1 мл этилацетата и образцы экстрагировали при комнатной температуре в течение часа в ультразвуковой бане, а затем еще час на шейкере при 145 об / мин (частота вращения двигателя). После этого образцы центрифугировали, супернатант выпаривали в потоке азота при комнатной температуре, а полученный остаток восстанавливали в 100 мкл 60% ацетонитрила. Для экстракции DMC плазмы мышей 40 мкл плазмы осаждали 150 мкл ацетонитрила, встряхивали и центрифугировали.Супернатант упаривали при комнатной температуре в токе азота. Остаток растворяли в 50 мкл 60% ацетонитрила.

    Все полученные образцы были проанализированы с помощью ЖХ / МС. Эксперименты проводились на системе Ultimate 3000 (Dionex, LCPackings, Вена, Австрия), соединенной с LTQ Orbitrap (ThermoFinnigan, Вена, Австрия), с использованием источника ионов ESI в положительном режиме. Система управлялась Xcalibur Software 1.4. Хроматографию проводили на колонке Gemini C18, 20 × 5 мм 3 мкм (Phenomenex, Торранс, США), используя 0.1% муравьиной кислоты в воде (A) и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (B) в качестве подвижной фазы. Разделение проводили в условиях градиентного элюирования: от 60% B до 90% B за 8,5 мин, поддерживая постоянным 90% B в течение 3 минут и повторно уравновешивая в течение 4 минут. Скорость потока составляла 200 мкл / мин при 30 ° C, объем впрыска 20 мкл. Для измерений масс-спектрометрии отслеживали одновременно 2 события сканирования: режим сканирования в FTMS и сканирование продуцируемых ионов 269 (CID 35) в ионной ловушке LTQ.

    Иммуноблоттинг

    Приготовление экстрактов дрожжевых клеток для анализа аутофагии EGFP-Atg8 и определение уровней экспрессии HA-меченных белков Atg выполняли, как описано 17 .Таким образом, три OD 600 единиц клеток (~ 1 × 10 8 клеток) были собраны центрифугированием при 10000 × g в течение 1 мин, промыты один раз 500 мкл H 2 O и повторно суспендированы при 300 мкл лизиса. буфер (1,85 М NaOH, 7,5% 2-меркаптоэтанол) и инкубируют в течение 10 мин на льду. Затем добавляли 300 мкл 55% трихлоруксусной кислоты, образцы кратковременно перемешивали и инкубировали еще 10 мин на льду. Осадок осаждали центрифугированием при 10,000 × g при 4 ° C в течение 10 мин и супернатант удаляли (с последующим коротким вращением для удаления остаточного супернатанта).Осадок ресуспендировали в 150 мкл буфера для образцов (200 мМ Трис / HCl pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 120 мМ DTT, 0,004% бромфенолового синего), помещали в ультразвуковую ванну на 5 минут и затем кипятили в течение 5 минут. при 95 ° С. Перед гель-электрофорезом образцы центрифугировали при 10000 × g в течение 1 мин.

    Иммуноблоттинг проводили по стандартным протоколам. Блоты исследовали с помощью мышиных моноклональных антител против GFP (Roche, [# 1814460], 1: 5000 в TBS + 1% сухого молока) или НА (Sigma-Aldrich, [H-9658], 1:10 000 в TBS + 1% сухого молока). молоко) и соответствующее аффинно очищенное вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой (Sigma, [# F-9137], 1: 10 000 в TBS + 1% сухого молока).

    Для экспериментов на культуре клеток человека белки экстрагировали из клеток с помощью буфера для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA). Двадцать пять микрограммов белков разделяли на 4–12% бис-трисакриламиде (Thermo Fisher Scientific Inc.) и электропереносили на мембрану Immun-Blot® PVDF (Biorad). Затем мембраны разрезали горизонтально на различные части в соответствии с молекулярной массой представляющий интерес белок, чтобы обеспечить одновременное обнаружение разных антигенов в одном эксперименте.Сайты неспецифического связывания насыщали путем инкубации мембран в течение 1 часа в 0,05% Tween 20 (об: об. В TBS) с добавлением 5% обезжиренного сухого молока (w: v в TBS) с последующей инкубацией в течение ночи с первичными антителами, специфичными для LC3B (Cell Signaling Technology, [# 2775], кролик, 1: 1000) и SQSTM1 / p62 (Abnova, клон 2C11, [# H00008878-M01], мышь, 1: 10 000). Разработка выполнялась с соответствующими вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP) (Rabbit-HRP, Thermo Scientific, [# 31460], 1: 5,000; Mouse-HRP, Thermo Scientific, [# 31430], 1: 5,000), плюс Super Хемилюминесцентный субстрат Signal West Pico (Thermo Fisher Scientific Inc.). Антитело против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы использовали для контроля равной загрузки дорожек (для экспериментов с дрожжами: антитело было подарком от доктора Гюнтера Даума, кролик, 1:40 000; для экспериментов на человеческих клетках и мышах: Cell Signaling Technology , клон D16h21, [# 5174], кролик, 1: 10 000). Для тестов эффективности нокдауна миРНК GATA и контролей (дополнительная фигура 13) были использованы следующие антитела: Thermo Fisher Scientific # PA1099X, кролик, 1: 500 (GATA1), Thermo Fisher Scientific [# 710242], кролик, 1: 100 ( GATA2), Технология передачи сигналов клеток [# 5852], кролик, 1: 1000 (GATA3), Технология передачи сигналов клеток [# 36966], кролик, 1: 1000 (GATA4), Thermo Fisher Scientific [# PA547262], коза, 1: 200 (GATA5), Cell Signaling Technology [# 5851], кролик, 1: 1000 (GATA6), Abcam [# ab48820], rabbit, 1: 2000 (TRPS1), Cell Signaling Technology [# 12994], кролик, 1: 1000 ( Атg5).Полное сканирование всех иммуноблотов показано на дополнительном рисунке 17.

    Статистический анализ

    Число независимых биологических повторов ( n ) указано в подписях к рисункам соответствующих графиков. Если не указано иное, независимость определяется для экспериментов с дрожжами как разные клоны или трансформанты, выдержанные отдельно; для клеточных культур как отдельно обработанных культур; для C. elegans , эксперименты на дрозофиле и мышах как на разных животных.Размер образца был предварительно оценен на основе величины эффекта, наблюдаемого в начальных экспериментах с дрожжами. Ослепления в экспериментах не было. При соблюдении критериев нормальности (рассчитанных с помощью тестов Колмогорова-Смирнова и Бартлетта) значения P были рассчитаны с использованием теста Стьюдента t (двусторонний, непарный) или подхода дисперсионного анализа (ANOVA) (для более чем две группы), после чего следует апостериорный тест Бонферрони. Непараметрические данные были проанализированы с использованием теста Краскела – Уоллиса с поправкой Данна на множественное сравнение.При необходимости данные были преобразованы в логарифмической шкале для достижения нормальности и однородной дисперсии, а также для оценки значимости преобразованных данных. Для данных с двумя переменными (например, лечение и штамм) был проведен двухфакторный дисперсионный анализ с последующим тестированием простых основных эффектов (множественные сравнения с поправкой на Бонферрони различных уровней каждого фактора в случае значимого основного фактора или взаимодействия).

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *